2017 Fiscal Year Research-status Report
発生分化における遺伝子の核内配置と転写の動的挙動の解析
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17K07416
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
村本 哲哉 東邦大学, 理学部, 講師 (10612575)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 遺伝子発現動態 / イメージング / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1細胞レベルでの解析手法の発展により、形態学的に同一に見える細胞においても、mRNAやタンパク質の量が細胞間で異なる不均一性が数多く報告されている。私はこれまで生細胞内で起こるRNAの産生を経時的に計測する技術を用いて、発生分化過程の最初期遺伝子が同じシグナル刺激に対して細胞間で異なる転写の強度や頻度を示す様子や、未分化状態で転写される遺伝子の細胞間での不均一性をとらえてきた。そこで、この不均一性を示す細胞での標的遺伝子の核内配置を経時的に可視化するため、ゲノム編集技術を用いた解析を行っている。標的配列に対するsgRNAを設計し、dCas9-GFPと合わせて細胞内で発現させた結果、生細胞内で効率的な輝点が観察されなかった。その原因としてsgRNAの発現効率が低い可能性を考え、tRNAのプロセシング過程を利用した発現系を構築した結果、核内でのdCas9とsgRNAの結合割合が増加し、dCas9-GFPの局在が変化した。このdCas9とsgRNAの結合能は、ゲノムへのdCas9の結合によってRNAポリメラーゼの伸長反応が阻害されたことからも確認できた。この発現系を利用して複数遺伝子の遺伝子改変を試みたところ、Cas9およびsgRNAの一過的発現にも関わらず、効率的に複数遺伝子を同時改変することができ、一過的発現によるオフターゲット効果を低減した汎用性の高い複数遺伝子改変手法を確立した。そこでこの発現系を用い、標的配列の数や標的部位、sgRNAに結合できるGFP分子の数などを変えることで特定のゲノム領域を可視化できる条件の検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
sgRNA発現系の問題点が解決され、さらにその手法を用いることで高効率の複数遺伝子改変手法を確立できたことから、おおむね予定通りに進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
標的配列の位置や数、sgRNAに結合できるGFP分子の数を変えることで、効率的なイメージング技術を確立していく。また、高効率の複数遺伝子改変手法が確立できたことから、ゲノムワイドsgRNAライブラリーを用いた効率的なスクリーニング系を確立していく。
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| Causes of Carryover |
遺伝子の核内配置の解析において検出効率を上げるために追加実験を行ったため、未使用額が生じた。このため、効率化の条件検討を次年度行うこととし、未使用額はその経費に充てることとしたい。
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