単一細胞解析による精子幹細胞システムの可塑性の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07424
• Research Institution: National Institute for Basic Biology
• Principal Investigator: 中川 俊徳 基礎生物学研究所, 生殖細胞研究部門, 助教 (50456894)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 精子幹細胞 / 幹細胞 / 精巣

Outline of Annual Research Achievements

ほ乳類の恒常的な精子の産生を担う精子幹細胞は、「Actual stem cell (ASC)」と「Potential stem cell (PSC )」という二つの機能的に異なる集団から構成される。PSCは正常な精子形成時では分化するが、傷害後の再生時では、その予定運命を転換しASCへと「逆戻り」する。この過程におけるPSCに起こる状態の変化を、単一細胞の遺伝子発現解析により明らかにすることを目的とした。
当初予定のRNA-seqによる遺伝子発現解析法では、遺伝子発現の検出感度と定量性が不十分であることが分かった。そこで、新しい実験系として、集積流体回路（FludigmC1、Biomark HD）をもちいたmultiplex qRT-PCRを行い、その実験系の評価を行った。その結果、正確に遺伝子の発現を定量可能であることがわかり、そちらで解析を行うことにした。この方法では全遺伝子の発現は解析できず、限られた数の遺伝子のみ発現を解析するため、ACSとPSCに特異性が高く発現する遺伝子発現をマイクロアレイにて検討し、約100遺伝子を選定した。それぞれのプライマーを設計し、数細胞より良好な増幅を行うプライマーセットを作成した。これらを用いて、定常状態における単一細胞の遺伝子発現解析を行った。その結果、新しい実験系は、検出感度も高く、標的遺伝子の大多数は実際の単一細胞から検出が可能であった。定量性も正確であり、おおよそ予想された結果と一致した。本研究には実験の再現性が最も重要となることから平成30年度については、その点も重要な実験計画として取り上げる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本実験の最も重要となる、単一細胞の遺伝子発現解析方法の選定に時間を費やしたため。

Strategy for Future Research Activity

新たに導入した実験方法の再現性や検出感度について検討する。
それを用いて、定常状態の精子幹細胞の解析を行う。終了し次第、再生過程の解析を開始する。また、同時並行的によりよい標的遺伝子の選定も行う。

Causes of Carryover

最も費用のかかると考えられていた実験を、次年度に行うため。来年度はそれを含め、遺伝子の発現解析を行う。