2019 Fiscal Year Research-status Report
クロロフィル結合モチーフをもつ低温誘導型チラコイド膜タンパク質LILの機能解析
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17K07431
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田中 亮一 北海道大学, 低温科学研究所, 准教授 (20311516)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 光合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
寒冷圏の多くの植物は低温下(凍結をしない程度の気温)で光障害を受けずに光合成をすることができる。寒冷圏の植物は光障害を回避するために、吸収した光エ ネルギーを熱として放散する複数のメカニズムをもつと考えられる。本研究では低温下で誘導されるLILに焦点をあて、LIL複合体の分離精製と解析およびLIL欠 損植物の光合成やエネルギー移動の解析をとおして、植物の低温下での光合成維持機能の一端を明らかにする事を目指す。
本年度は昨年の予備的なRNAseqのデータをもとにイチイのLIL遺伝子の遺伝子モデルを作成した。これにより、イチイには１０種類以上のLIL1遺伝子が存在していることが明らかになった。おおまかに、LIL1には少し分子量の大きいフォームと小さいフォームが存在し、小さいフォームが大部分を占めることが明らかとなった。現在、最も発現量の多いLIL1遺伝子の配列をもとに、シロイヌナズナの形質転換植物の作成を進めているところである。また、この遺伝子の配列をもとにペプチド抗原を作成した。その結果、冬のイチイのサンプルで12 kDのタンパク質を検出することができた。このタンパク質はLIL1の小さいフォームに相当すると考えられる。また、予備的な結果ではあるが、イチイチラコイド膜タンパク質をNative電気泳動によって分離したところ、LIL1が高分子の光化学系複合体に結合していることが示唆された。
さらに、昨年度のイチイの光化学系II量子収率の年間変動が機器の不具合から低めに計測されていることがわかったので、このデータの再取得を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
2018年9月に北海道で大規模な停電があり、凍結していたサンプルの多くが融解してしまった。これらの試料の調整をやり直したため、全体の計画が遅れてしまった。 また、光化学系II量子収率(Phi2)の測定に用いていた測定装置MultispeQ についてもファームウエアの不具合によって光強度の測定に大きな誤差が生じたため、2019年4月から一部のデータの再測定を行っている。また、Phi2の修正に用いたプロトコルの前半部分に余計な光をあてるステップが存在していたので、その部分を取り除くなど、プロトコルの最適化も同時に行った。RNAseqのデータに関しては、予備的な解析は終了しているが、本解析を行う必要があり、現在、年間サンプルの収集を継続しているところである。総合的に半年程度の遅れが生じている。
しかし、上述したようにLIL1の遺伝子配列をもとにしたペプチド抗体の作成は成功したので、LIL1のタンパク質レベルの年間変動を調べる実験を進行中である。現在、収集しているサンプルは、RNA, タンパク質、色素の分析のすべてに用いる予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、遅れていた光化学系IIの量子収率の測定と試料の収集を７月までに終了させる予定であり、Phi2に関しては、現在、毎週測定を行っている。また、この試料について、RNAseq, immunoblotting（光化学系のタンパク質とLIL1を中心に行う）光合成色素の測定を予定している。これらの結果から、LIL1に限らず、LILタンパク質群の変換変動が明らかになるはずであり、また、その結果をPhi2の変動、光化学系の構成や光合成色素の組成の変化と関連付けることが可能となる。さらに、イチイのLIL1を発現するシロイヌナズナ（作成中）の形質（とくに光化学系の応答やクエンチング）、および他の光化学系タンパク質との相互作用を解析することで、LIL1の機能を明らかにする予定である。さらに、冬のイチイのチラコイド膜において、LIL1と相互作用するタンパク質をNative電気泳動を用いて解析することも予定している。これらの実験によって、LIL1やその他のLILタンパク質の機能を明らかにしたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
2018年9月に北海道で大規模な停電があり、凍結していたサンプルの多くが融解してしまった。これらの試料の調整を やり直したため、全体の計画が遅れてしまった。 また、光化学系IIの量子収率の測定に用いていた測定装置MultispeQ についてもファームウエアの不具合によって光強度の測定に大きな誤差が生じたため、2019年4月から一部のデータの 再測定を行っている。総合的に半年程度の遅れが生じている。しかし、現在では、Phi2, タンパク質レベルでの測定、RNAseqに関して技術的な問題はないと考えており、R2年度の試料に収集と解析を終了させるとともに、現在作成中のシロイヌナズナ形質転換体の解析を通して、LILタンパク質の相互作用と機能を明らかにする予定である。
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