2017 Fiscal Year Research-status Report
液胞形成に伴って起こる新奇オートファジーの機構解明
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17K07434
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
森安 裕二 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (20200454)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金子 康子 埼玉大学, 教育学部, 教授 (30194921)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 液胞形成 / オートファジー / ミニプロトプラスト / BY-2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
液胞形成に伴うオートファジーがマクロオートファジーとは異なることを証明するために、マクロオートファジーが欠損しているシロイヌナズナATG5遺伝子破壊株の胚軸から培養細胞を作製し、それから調製したミニプロトプラストを用いて実験を進めていた。しかし、2018年度10月～12月になって、植え継ぎの過程で破壊株培養細胞に野生型培養細胞が混入していることが判明し、新たにシロイヌナズナ培養細胞を作製し直す必要がでてきた。そこで急遽、シロイヌナズナ芽生えからカルスを改めて調製し直している。
タバコBY-2ミニプロトプラストを光学顕微鏡で観察した。ミニプロトプラストでオートファゴソームが活発に形成され、液胞形成が進むとオートファゴソームは消失した。マクロオートファジー阻害剤3-メチルアデニンで処理するとオートファゴソームは始終見られなくなったが、形成される液胞の大きさに差はなかった。すなわち、3-メチルアデニンによりオートファゴソーム形成を阻害しても液胞の形成は阻害されないことを確認した。一方で、液胞除去後30分以内に、核の周辺に酸性構造が現れ、これらの小さな構造が融合して液胞が形成されるように見えた。この酸性構造が、これまでに電子顕微鏡で観察している「核周辺のERから形成される特殊な構造」に対応している可能性が考えられた。
化学固定法で固定したタバコBY-2ミニプロトプラストを電子顕微鏡で観察した。オートファゴソームは、細胞膜周辺のERあるいは細胞膜そのものを元として形成された板状構造が重なりあって形成されるように見えた。板状構造にはリボソームとは異なる電子密度の高い顆粒が多数、付着していた。板状構造が2枚以上重なることでオートファゴソームが形成されるように見えた。一方で、核周辺にER由来の特殊な構造が観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
1. シロイヌナズナ培養細胞を用いた実験が振り出しにもどることになったので。
2. 高圧凍結・凍結置換法で固定してミニプロトプラストを観察する計画を立てていたが実行できなかったので。
3. 液胞形成を行っているタバコBY-2ミニプロトプラストより経時的にタンパク質を抽出し、二次元電気泳動法で分離する計画を立てていたが、予備実験しかできなかったので。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. シロイヌナズナATG5遺伝子破壊株の胚軸から培養細胞を調製する。
2. 高圧凍結・凍結置換法で固定してミニプロトプラストを観察し、核周辺にい現れるER由来の特殊な構造がオートファジーを行っている像を捉える。
3. 二次元電気泳動法によるタンパク質の解析を行う。
4. ミニプロトプラストを蛍光顕微鏡で観察し、酸性ホスファターゼ酵素化学染色により、核周辺に現れる酸性構造がリソソームマーカーである酸性ホスファターゼを持っていることを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
ほぼ計画通り使用したが、端数が余った。次年度分として請求している助成金と合わせて、次年度の使用計画通りに使用する。
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