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2017 Fiscal Year Research-status Report

トレニアのシュート再生系を用いた脱分化とシュート頂分裂組織新構築の解析

Research Project

Project/Area Number 17K07437
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

杉山 宗隆  東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 准教授 (50202130)

Project Period (FY) 2017-04-01 – 2020-03-31
Keywordsトレニア / シロイヌナズナ / シュート再生 / 表皮細胞 / 脱分化 / 細胞分裂 / シュート頂分裂組織 / 不定芽
Outline of Annual Research Achievements

トレニアの茎断片培養系において、シュート再生に対するサイトカイニンと光の影響を調べ、その結果に基づいて、1 mg/lのベンジルアデニン(BA)を添加して連続明で培養する条件をシュート再生が安定して高頻度で起きる標準条件、BAを添加せずに連続明で培養する条件とBAを添加して暗所で培養する条件をシュート再生頻度がきわめて低い対照条件として設定した。各条件について、核の染色性に基づいて脱分化を評価するとともに、細胞分裂の開始から不定芽のシュート頂分裂組織(SAM)に至るまでの細胞分裂の様相を連続観察等により追跡した。その結果、脱分化は茎断片を切り出す操作それ自体によって誘起され、脱分化後の細胞分裂の活性化にサイトカイニンと光が関与すること、SAMの領域は細胞分裂がある程度進んでから決定されることなどが示唆された。
トレニアの主要なSAM制御遺伝子ホモログを同定し、シュート再生過程におけるそれらの発現変動をRT-qPCR解析により検討した。さらにRNA-seqによりトランスクリプトームデータを取得し、クラスタリング等の解析を行って、遺伝子発現プロファイルを明らかにし、傷害応答経路がはたらいている可能性などを示した。
トレニアの形質転換体を作出し、挿し木によって殖やした後に、茎断片を培養してシュート再生を誘導するモデル実験を成功させ、効率的な実験サイクルの確立に目処をつけた。
シロイヌナズナを用いた解析では、変異原処理を行ったrgd3の後代を探索し、抑圧変異体候補を1株見出した。また、2段階式シュート再生系において、カルス誘導段階のIAA生合成阻害がシュート再生能を高めることを発見し、内生IAAが再生能を負に制御していることを初めて示した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

年度当初には、トレニアについては、形質転換、栄養繁殖、茎断片からのシュート再生を組み合わせ、シュート再生研究のための効率的な実験サイクルを確立すること、茎断片からのシュート再生過程について、クロマチン構造変化や細胞分裂、SAM制御遺伝子発現などの諸事象の時空間的進行を記載すること、RNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行うことを、シロイヌナズナについては、2段階培養系において、シュート再生時のSAM新構築に関し顕著な温度感受性を示すrgd3変異体を用い、SAM新構築に焦点を当てたトランスクリプトーム解析を行うことと、変異原処理を施したrgd3後代のスクリーニングにより、rgd3抑圧変異体を単離することを、それぞれ計画した。これらのうち、シロイヌナズナのrgd3を用いたトランスクリプトーム解析以外は、ほぼ達成することができた。シロイヌナズナでは、IAA生合成阻害剤がカルスのシュート再生能を高めるという予期せぬ発見があったため、rgd3のトランスクリプトーム解析を延期して、再生能制御における内生IAAの役割を追究したが、それに値する興味深い結果が得られた。全体として見れば、本研究は概ね順調に進んでいると判断される。

Strategy for Future Research Activity

昨年度のRNA-seq解析により、トレニア茎断片培養系のシュート再生について、トランスクリプトームデータを取得したので、新年度は主としてこれを基盤として研究を進める。遺伝子発現プロファイルを分析し、脱分化、細胞分裂活性化、SAM新構築の各過程について、密接に連関する遺伝子群を特定する。特定した遺伝子の中から、とくに重要と思われるもの、興味深いものを選抜し、RT-qPCR解析により、様々な条件における時間的発現パターンの詳細を明らかにするとともに、in situハイブリダイゼーションにより、空間的発現パターンを明らかにする。また、SAMのパターン形成開始に関わる可能性が高い遺伝子については、各遺伝子のレポーターを作製してトレニアに導入し、SAM構築前後の発現パターンをライブで観察できるようにする。これを活用して、SAM構造の自律的構築の仕組みを追究していく。
昨年度までの研究から、トレニア茎断片培養系では、茎断片を切り出す操作それ自体が傷害応答経路を介して脱分化を誘導すること、脱分化に伴って核小体が発達することが示唆されている。脱分化過程での核構造の変化を、各種の特異的蛍光プローブを用いた観察等により詳しく記載し、これらの核構造の変化を指標に、脱分化の誘導要因を広く調査する。
当初計画の一部に含めていた、シロイヌナズナの2段階培養系におけるシュート再生の解析は、内容を拡大して他のプロジェクトで本格的に取り組むことになった。これを受けて、本研究では今後、シロイヌナズナ2段階培養系を用いた解析は副次的な位置づけに移し、その分トレニア茎断片培養系を用いた解析に注力する予定である。

  • Research Products

    (16 results)

All 2018 2017

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (13 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Journal Article] Plant nucleolar stress response, a new face in the NAC-dependent cellular stress responses2018

    • Author(s)
      Iwai Ohbayashi, Munetaka Sugiyama
    • Journal Title

      Frontiers in Plant Science

      Volume: 8 Pages: Article 2247

    • DOI

      10.3389/fpls.2017.02247

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Partnership for callusing2018

    • Author(s)
      Munetaka Sugiyama
    • Journal Title

      Nature Plants

      Volume: 4 Pages: 69-70

    • DOI

      10.1038/s41477-018-0104-2

  • [Journal Article] Evidence for a role of ANAC082 as a ribosomal stress response mediator leading to growth defects and developmental alterations in Arabidopsis2017

    • Author(s)
      Iwai Ohbayashi, Chung-Yi Lin, Naoki Shinohara, Yoko Matsumura, Yasunori Machida, Gorou Horiguchi, Hirokazu Tsukaya, Munetaka Sugiyama
    • Journal Title

      The Plant Cell

      Volume: 29 Pages: 2644-2660

    • DOI

      10.1105/tpc.17.00255

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] A role of endogenous IAA in regulating shoot regeneration competence in 2,4-D-induced callus of Arabidopsis2018

    • Author(s)
      Yuki Sakamoto, Hiroyuki Kasahara, Munetaka Sugiyama
    • Organizer
      The 59th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists
  • [Presentation] Effects of the age-dependent increase of leaf primordial power inhibiting new primordium initiation on phyllotactic pattern generation and its possible relation to the auxin transport-based model2018

    • Author(s)
      Takaaki Yonekuara, Akitoshi Iwamoto, Hironori Fujita, Munetaka Sugiyama
    • Organizer
      The 59th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists
  • [Presentation] Cytological and gene expression analyses on advenetitious bud formation from the epidermis in cultured stem segments of Torenia fournieri2018

    • Author(s)
      Hatsune Morinaka, Akihito Mamiya, Akitoshi Iwamoto, Hiroaki Tamaki, Takamasa Suzuki, Yoshikatsu Sato, Momoko Ikeuchi, Akira Iwase, Keiko Sugimoto, Tetsuya Higashiyama, Munetaka Sugiyama
    • Organizer
      The 59th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists
  • [Presentation] Upstream ORF-mediated translational regulation in response to nucleolar stress in Arabidopsis2018

    • Author(s)
      Shun Sasaki, Rin Kudo, Shun Watanabe, Iwai Ohbayashi, Munetaka Sugiyama, Yuriko Osakabe, Keishi Osakabe, Satoshi Naito, Hitoshi Onouchi
    • Organizer
      The 59th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists
  • [Presentation] A critical role of the NAC transcription factor ANAC082 in ribosomal stress signaling of plant cells2018

    • Author(s)
      Iwai Ohbayashi, Shun Sasaki, Chung-Yi Lin, Naoki Shinohara, Yoko Matsumura, Yasunori Machida, Gorou Horiguchi, Hirokazu Tsukaya, Masahiko Furutani, Hitoshi Onouchi, Munetaka Sugiyama
    • Organizer
      The 59th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists
  • [Presentation] A quartet of NAC transcription factor genes is upregulated in response to abnormal ribosomal proteins and enhances leaf abaxialization in asymmetric leaves22018

    • Author(s)
      Gorou Horiguchi, Iwai Ohbayashi, Munetaka Sugiyama, Hirokazu Tsukaya
    • Organizer
      The 59th Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Physiologists
  • [Presentation] Restrictive role of mitochondria on pericycle cell divisions during lateral root initiation2017

    • Author(s)
      Akihito Mamiya, Kurataka Otsuka, Kayoko Yamamoto, Mamoru Nozaki, Yusuke Yagi, Takahiro Nakamura, Takashi Ueda, Takashi Hirayama, Munetaka Sugiyama
    • Organizer
      8th International Symposium on Root Development
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 拡張Douady・Couderモデルのパラメータ空間における葉序パターンの分布2017

    • Author(s)
      米倉 崇晃, 岩元 明敏, 藤田 浩徳, 杉山 宗隆
    • Organizer
      第27回日本数理生物学会年会
  • [Presentation] シロイヌナズナのリボソームストレス応答とNAC転写因子ANAC082の役割2017

    • Author(s)
      大林 祝, 林 忠逸, 篠原 直貴, 松村 葉子, 町田 泰則, 堀口 吾朗, 塚谷 裕一, 杉山 宗隆
    • Organizer
      日本植物学会第81回大会
  • [Presentation] トレニア茎断片培養系における表皮起源不定芽形成の初期過程の解析2017

    • Author(s)
      森中 初音, 間宮 章仁, 岩元 明敏, 玉置 裕章, 鈴木 孝征, 佐藤良勝, 池内 桃子, 岩瀬 哲, 杉本 慶子, 東山 哲也, 杉山 宗隆
    • Organizer
      日本植物学会第81回大会
  • [Presentation] シロイヌナズナの側根形成初期過程において高温下で過剰な細胞分裂をもたらすミトコンドリア異常の解析2017

    • Author(s)
      間宮 章仁, 大塚 蔵嵩, 野崎 守, 山本 荷葉子, 小林 健人, 八木 祐介, 中村 崇裕, 平山 隆志, 上田 貴志, 蜂谷 卓士, 野口 航, 杉山 宗隆
    • Organizer
      日本植物学会第81回大会
  • [Presentation] 葉序パターン生成モデルにおける葉原基抑制力の時間変化とその意味2017

    • Author(s)
      米倉 崇晃, 岩元 明敏, 藤田 浩徳, 杉山 宗隆
    • Organizer
      日本植物学会第81回大会
  • [Presentation] 不定根形成を指標としたシロイヌナズナDMSO高感受性変異体の単離と表現型解析2017

    • Author(s)
      野崎 守, 川出 健介, 塚谷 裕一, 杉山 宗隆
    • Organizer
      日本植物学会第81回大会

URL: 

Published: 2018-12-17  

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