2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K07438
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
今村 壮輔 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 准教授 (70548122)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 窒素代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
窒素は、植物の生長を左右する重要な栄養元素である。窒素に関する研究としては、窒素量の増減に応じた遺伝子発現など、窒素量変化に伴う最終的な応答反応については良く理解されている。その一方で、窒素量の変化を、植物細胞がどの様な機構で感知しているのか、という点については、多くの制御系・実験系が複雑であるなどの理由で解明がなされていない。そこで本提案では、単純な制御系を持つと考えられる単細胞紅藻Cyanidioschyzon merolaeに着目し、実験材料として用い、窒素源欠乏シグナルの受容や、そのシグナル伝達機構の解明を目的としている。
昨年度は、転写複合体の精製を目指して、エピトープタグ融合タンパク質として発現する株の取得を試みたが、大きなタグ(FLAG/Protein A/His)を付加した株を取得することができなかった。そこで、FLAGタグ融合タンパク質として発現する株の取得を行なった。本年度は、その株を用いて細胞から転写因子複合体の精製を試みた。FLAG抗体を用いた免疫沈降の各種条件検討を行ったのちに、目的タンパク質の精製に成功した。この精製画分をLC-MS/MS解析に供することで、転写因子自体の翻訳後修飾の可能性を検証した。その結果、興味深いことに、複数のリン酸化残基が同定され、そのリン酸化の程度は窒素源の有無によって変動する傾向が観察された。一方、転写因子自体の精製量が少なかったため、転写因子に結合する因子の同定には至らなかった。この問題を解決するために、細胞内でFLAG融合タンパク質が過剰に発現する形質転換体の取得を試みが、これまでに形質転換体の取得には至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、転写因子複合体を構成する因子を同定し、その機能解析を開始している計画であった。しかし、エピトープタグの影響が想像以上に大きく、形質転換体の取得に時間を要してしまっている。しかし、目的転写因子の免疫沈降の精製に成功し、その翻訳後修飾が明らかとなったため、窒素量に応じた新たな制御機構に繋がる新規知見を得ることに成功していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
翻訳後修飾の情報を基にして、修飾に関与する因子の特定を行う。また、転写因子の過剰発現体の取得については、条件特異的な発現系を使用するなど、現在問題となっている課題を解決することを試みる。また、当初計画していなかった方法（酵母ツーハイブリットなど）を用いることでも問題解決をはかる。
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