2018 Fiscal Year Research-status Report
紅藻シアニディオシゾンを用いたアブシシン酸シグナル伝達機構の進化の解析
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17K07439
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
小林 勇気 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (80644616)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 植物ホルモン / Cyanidioshyzon merolae / シグナル伝達 / 進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物ホルモンであるアブシジン酸（ABA）は近年の研究から植物・動物問わず、広い生物種間で発見されている。しかし、陸上植物以外におけるABAの機能やその制御メカニズムを解き明かした例は驚くほど少ない。特に受容体を始めとするシグナル伝達機構は陸上植物以外では不明な点が多く、ABAシグナル伝達の進化における大きな謎である。申請者は、原始紅藻Cyanidioshyzon merolae（シゾン）にもABAが存在し、高塩濃度環境での生存性を高めていることを明らかにした。また、陸上植物のABAシグナル伝達因子の一部がシゾンでも保存され、機能していることも発見した。しかし、シグナル伝達の要である受容体の発見には至っていない。そこで本研究では藻類におけるABA受容体の探索とシグナル伝達系の解明を目的とした。本研究では、以下のストラテジーでABA受容体の探索とシグナル伝達系の解明を行うことを計画している。(1)質量分析によるABAレセプターの探索、(2)酵母2ハイブリッド系によるABAレセプター及びABAシグナル伝達関連因子の探索、(3)陸上植物のABAレセプター候補因子のシゾンでの機能解析、(4)ABA応答遺伝子の特定、(5)ABAシグナル伝達に関わる因子の網羅的スクリーニング、(6)モデルの検証と高等植物への応用。本年度は昨年度からに引き続き(1), (2)について新規に開発したin vivo共発現系にて相互作用を確かめた。また(4)(5)について解析をおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は(1)質量分析によるABAレセプターの探索、(2)酵母2ハイブリッド系によるABAレセプター及びABAシグナル伝達関連因子の探索、(4)ABA応答遺伝子の特定、(5)ABAシグナル伝達に関わる因子の網羅的スクリーニングについて解析を行った。(1)及び(2)では昨年度候補が多すぎ、偽陽性の排除が問題であった。そのため、新たにin vivo共発現系を開発し、候補について検証をおこなった。これにより多くの偽陽性を排除することができた。しかし、未だすべての組み合わせでの検証は完了しておらず、次年度も引き続きおこなう。(4)に関してはマイクロアレイの実験を検討していたが、近年の次世代シークエンスの価格低下から次世代シークエンスの方が安価であり精度も高いため、次世代シークエンスに切り替えた。結果を解析することにより、ABA依存的及びABAと光条件の変化等に応答する遺伝子群を特定した。(5)に関しては２次元泳動法によって分離し、MS解析すする予定であったが、検出感度が低く同定できなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は (1)(2)から得られた候補を新規形質転換法により引き続き検証する。また (5)ABAシグナル伝達に関わる因子の網羅的スクリーニングを進め、ABA受容から遺伝子発現までの伝達経路の流れを明らかにする。(5)に関しては従来の方法では検出が難しいことが予測された。そこでABA添加・非添加でサンプルを調整しリン酸化タンパク質を特異的に精製するカラムにより精製したタンパク質群をLC-MSにより網羅的に検出する方法をとる。当大学内にLC-MSによるタンパク質の網羅的解析を専門に行う研究室があり、共同研究する予定である。
今後は、当初の予定通り、ABAシグナル伝達に関わる全ての因子を特定するのではなく、主要な経路を滞りなく繋げていくことを優先する。
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