細胞膜プロトンポンプ活性のライブイメージング技術の確立と応用

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07443
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 高橋 宏二 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (40283379)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 細胞膜プロトンポンプ

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、植物細胞のpH調節や膜電位制御を介したイオン等の二次輸送体活性調節を担う細胞膜H+-ATPase（細胞膜プロトンポンプ）の活性を簡便に検出することを目的に、活性に重要な役割を示すリン酸化H+-ATPaseと14-3-3タンパク質の二分子間相互作用を利用した蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）などによる可視化技術を適応することとした。本法を用いて細胞膜H+-ATPase活性を正しく検出するためには、FRET等のプローブとして導入した組換えH+-ATPaseの機能が正常であることが重要であり、細胞膜H+-ATPaseに融合するドナータンパク質の導入部位を最適化することがポイントになると考えている。そこで、本年度はまずシロイヌナズナの細胞膜H+-ATPase（AHA1）遺伝子とプロモーター領域および3'非翻訳領域をクローニングするとともに、単量体型の変異GFPの作製を行った。次に、AHA1の複数の細胞内領域に単量体型変異GFPを融合したGFP-AHA1タンパク質の発現ベクターを構築した。また、葉肉細胞プロトプラストへの一過的発現系で蛍光タンパク質融合タンパク質の発現を確認し、GFPの融合がH+-ATPaseのリン酸化に影響を及ぼさないか否かを中心に検討した。また、GFP融合H+-ATPaseとの二分子間相互作用を検出するために、14-3-3タンパク質とmCherryなどの蛍光タンパク質との融合タンパク質を作製した。GFP-AHA1とmCherry-14-3-3タンパク質の共発現によるFRETの検出は今後の課題である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

シロイヌナズナの細胞膜H+-ATPase遺伝子のひとつであるAHA1（Arabidopsis H+-ATPase1）遺伝子を、プロモーター領域および3’非翻訳領域を含む約11.5 kbのgenomic DNAをpCAMBIA1300ベクターにサブクローニングし、GFPとの融合タンパク質作出のためのベクター構築に用いた。また、GFPの二量体化によるGFP-AHA1のアーティファクトな複合体構造をとることを避けるため、GFPにQ69MとA206Kの変異を導入して単量体型GFPの作出を行った。また、GFPの導入がAHA1の機能に及ぼす影響を最小にすることが重要であるため、AHA1の複数の細胞内領域に変異GFPを導入し、AHA1のリン酸化や活性に及ぼす影響を比較している。14-3-3タンパク質とmCherryなどの蛍光タンパク質との融合タンパク質も作製しており、今後、共発現によるFRET検出の検討に用いることとする。

Strategy for Future Research Activity

今後も概ね計画通りに研究を推進する予定であるが、細胞膜H+-ATPaseのN末端領域への蛍光タンパク質融合がH+-ATPaseの機能に部分的に影響を及ぼすことが示された（Haruta et al. Plant Physiol., 2018）ため、GFPを導入する部位としてN末端領域の他にも複数の細胞内ドメインへの導入も検討することにした。細胞膜H+-ATPaseの機能に影響を及ぼさないようにドナータンパク質を導入することが本研究の成否に関わると考えているので、ドナータンパク質を融合することによるH+-ATPase機能や細胞内局在への影響を検討し、AHA1プロモーターに連結したGFP-AHA1をaha1変異体に形質転換して表現型が完全に相補されるか、また、GFP-AHA1の細胞内局在が正常であるかどうかを中心に詳細な観察を行い、まずは機能的なGFP-AHA1を発現する形質転換植物を作出する。