2019 Fiscal Year Annual Research Report
Live-imaging of PM H+-ATPase activity
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17K07443
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
高橋 宏二 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (40283379)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 細胞膜H+-ATPase / リン酸化 / FRET |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、植物の細胞膜H+-ATPaseの活性を生体内において簡便に効率よく検出することを目的に、活性化型プロトンポンプと14-3-3 タンパク質の二分子間相互作用を利用した蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）などによるプロトンポンプ活性の可視化技術の確立を目指した。これまでの研究で、GFP-AHA1 とmCherry-14-3-3 タンパク質などさまざまな蛍光タンパク質の組み合わせの共発現によるFRET の検討したが、フシコクシンや生理学的刺激による効果的なFRETの検出はごくわずかであり、実用化には至らなかった。そこで本年度は、G-CaMPに準じて円順列変異体型GFPのN末端側とC末端側にそれぞれ14-3-3タンパク質とAHA1を融合させたタンパク質コンストラクトを作製した。リンカー配列にさまざまな工夫を施したところ、MCP一過的発現系においてフシコクシン処理依存的な蛍光シグナル強度の増大がわずかではあるが認められた。現在、植物体における機能評価を試みるとともに、生理的な刺激による蛍光シグナル強度の変更の観察を行う準備を行っているところである。一方で、AHA1センサーの実用化を困難にしている要因のひとつとして、活性を保持するAHA1の高発現系を作出すると植物細胞や植物体に影響を及ぼすために発現量をあまり高めることができないことが推察された。そこで、当初の計画にはなかったが、H+-ATPase活性に関わると考えられているリン酸化アミノ酸（T881、S889、S931）に変異を施したAHA1の作出をおこなった。現在、これら変異AHA1 をセンタータンパク質の構成要素として利用する系を作出している。これにより、高発現させても植物体には影響を及ぼさず、C 末端から２番目のスレオニン残基のリン酸化レベルのみを評価できるセンサータンパク質の完成が期待される。
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