2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K07450
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
小泉 望 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (20252835)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 小胞体 / RNA分解 / シロイヌナズナ / ゼニゴケ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の機能発現には正しいfoldingが必要である。小胞体膜上のリボソームで合成されるタンパク質のmRNAの多くはストレス等によりそのコードするタンパク質のfoldingが阻害されると、小胞体膜上のセンサータンパク質IRE1が持つRNase活性により分解される。このmRNA分解はRIDD（Regulated IRE1 Dependent Decay of mRNA）と呼ばれfolding異常タンパク質の小胞体への流入軽減に働くと考えられる。一方、IRE1はRIDDに加えて転写因子bZIP60のmRNA分解（細胞質スプライシング）にも関わる。bZIP60はこの細胞質スプライシングによって活性化され小胞体シャペロンの誘導に働き、小胞体内でのタンパク質のfolding以上の回復に働く。つまり、IRE1は小胞体膜上の２つのRNA分解機構により小胞体の恒常性維持に働く。しかし、こうした２つの分解機構の使い分けや分解機構の生理機能への関与は植物では必ずしも明らかでない。そこでこうした疑問に答えるために、本研究ではIRE1に着目した。基本的にはシロイヌナズナを用いて、次の項目で研究をおこなった。１）RIDDにより分解される分泌性タンパク質のmRNAとタンパク質機能の相関、２）個体レベルでの機能欠損の解析（この研究では主にゼニゴケを用いた）３）RIDDにより切断されるmRNAの標的配列の同定、４）RIDDにおけるmRNAの分解に働くRNaseの同定、５）bZIP60の細胞質スプライシングにより生じる新たなORFの機能について研究を行うこととした。本年度１）、２）、３）、５）において進捗が見られた。詳細は現在までの進捗状況に記載する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）RIDDにより分解される分泌性タンパク質のmRNAとタンパク質機能の相関 RIDDによりmRNAが分解されるが、IRE1欠損株ではmRNA分解は起こらない。その場合、タンパク質が正常に翻訳されるかどうかという疑問が生じる。そこで小胞体に負荷がかかった場合に野生型とIRE1欠損株でRIDDの標的となるmRNA由来のタンパク質の翻訳をモニターできる系の確立を目指した。具体的にはRIDDの標的となることが分かっているSP-GFP（シグナルペプチドを付加したGFP）をDEXにより誘導できる植物の作出を行った。現在、この植物を用いて解析中である。
２）個体レベルでの機能欠損の解析 この研究ではシロイヌナズナとゼニゴケを用いた。シロイヌナズナのIRE1欠損株では顕著な表現型の変化は見られなかった。ゼニゴケに関してはCRIPR/Cas9によるIRE1破壊株の作出をおこなった。IRE1破壊株は糖鎖合成阻害剤ツニカマイシンに明らかな感受性を示し、野生型と比べて生育遅延を示した。
３）RIDDにより切断されるmRNAの標的配列の同定 IRE1により切断されるmRNAの末端が特殊な構造を持つことを利用して、大腸菌由来のRNAリガーゼRtcBによりリンカーを付加して、PCR、シークエンスを行うことでRIDDにより分解されたmRNAの末端の同定を試みた。RtcBの精製から実験を行い、精製に成功したが、効率よく末端配列の同定をおこなうことには至っていない。
５）bZIP60の細胞質スプライシングにより生じる新たなORFの機能 シロイヌナズナのプロトプラストを用いた一過性発現系において新奇ORFを付加したbZIP60は強い活性化能を示した。従って、新奇ORFが何らかの役割を持つと考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）RIDDにより分解される分泌性タンパク質のmRNAとタンパク質機能の相関 H29年度に作出した形質転換植物（シロイヌナズナ）を用いて、SP-GFPをDEXにより発現させるとともにツニカマイシン処理により小胞体へ負荷を与える状態を生じさせる。この時のGFP mRNAとGFPタンパク質の相関を観察する。
２）個体レベルでの機能欠損の解析 IRE1欠損ゼニゴケの解析を行う。シロイヌナズナではIRE1欠損により花粉の成熟に異常が出ることが報告されているため、生育遅延に加えて造精器の発達、精子の運動性などについて観察をおこなう。
３）RIDDにより切断されるmRNAの標的配列の同定 RtcBの精製度を挙げるとともに、polyA(+) RNAを用いるなど実験系を改良し、網羅的な同定につなげる。また、SP-GFPの塩基配列に変異を導入し、切断が起こらなくなるかどうかを調べることで切断箇所の同定につなげる。
５）bZIP60の細胞質スプライシングにより生じる新たなORFの機能 新奇ORFが付加されることによる転写活性の増大がタンパク質量によるものか、活性化能そのものによるものかタンパク質量の増加によるものか調べる。また、新規ORF中のこの転写活性化能の増加に関わる箇所（アミノ酸配列）を同定する。ORFの付加によりタンパク質量が増加するのであれば、他のタンパク質（例えばGFP）にこの配列を付加し、その効果を検証する。
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