2018 Fiscal Year Research-status Report
魚類と両生類の比較解析から解き明かすバソプレシン/バソトシンV2受容体の機能進化
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17K07468
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
今野 紀文 富山大学, 大学院理工学研究部(理学), 講師 (50507051)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | バソトシン / バソトシン受容体 / メダカ / 浸透圧調節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、真骨魚類と両生類において、バソトシンV2aRとV2bRの機能を明らかにすることである。これらの機能を両動物群で比較することで、V2受容体の機能進化が脊椎動物の環境適応の歴史（水生から陸生への進化）にどのような影響を与えたのかという、生命進化の謎の解明を目指している。平成29年度の研究により、V2aR-KOメダカの鰓で水チャネルAQP3の発現が低下していることが解ったため、鰓のAQP3の発現制御にバソトシン-V2aR系が関連していると仮説し、以下のことを調べた。メダカV2aRを安定発現させた培養細胞を樹立し、その細胞にAQP3の5'上流領域（約2.3 kbp）とレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を連結した発現ベクターを導入後、リガンド添加によるレポーター遺伝子の発現をルシフェラーゼアッセイにより調べた。ポジティブコントロールのcAMP応答配列+レポーター遺伝子の導入ではリガンド添加により顕著な反応が見られたが、導入したAQP3の5'上流領域に対する反応は検出されなかった。導入したプロモーター領域内に発現制御に関わるサイトが存在しなかった可能性が考えられる。また、in situ hybridizationによりAQP3とV2aRの局在を調べたところ、鰓の塩類細胞にAQP3に対するシグナルが検出されたが、V2aRに対するシグナルはその発現量の低さから検出できなかった。今後は昨年度作製したV2aR発現を可視化するトランスジェニックメダカを用いて鰓でのV2aRとAQP3との局在を明らかにしていく。また、現在は、V2受容体に限らず、V1受容体が魚類の環境適応（浸透圧環境への適応）に関与している可能性も検証している。これまでに、V1aR1とV1aR2に対するKOメダカを作出し、両受容体機能を共に欠損させたダブルKOの系統化にも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
V2aRを介した機能についてはある程度の成果を出しつつあるが、V2bRを介した機能については少し遅れている。これまでにV2bRをノックアウトしたメダカの系統化は完了しているが、表現型解析において際立った表現型が確認できていないため、VTがV2bRを介してどのような機能を担っているかが推定できていない。RNA-Seqによる網羅的な解析が有効であるが、現時点でRNA-seq解析を行う予算的余裕が無く、in situ hybridizationでも発現量の低さが課題となってV2bRが発現する細胞を特定できていない。また、ネッタイツメガエルの受容体ノックアウト作製も遅れている。ネッタイツメガエルの胚発生が早く、導入した遺伝子がその効果を発揮する前に多細胞化するため変異配列が生殖細胞に導入されていない可能性が高い。
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| Strategy for Future Research Activity |
現時点でV2aRノックアウトによる表現型が確認できている鰓のAQP3に注目して研究を進める。AQP3遺伝子のプロモーター領域を5'側に延長し、新たな解析用ベクターを作製して、再度、ルシフェラーゼアッセイを試みる。また、AQP3とV2aRが塩類細胞で共局在しているかどうかを確認するため、V2aRトランスジェニックメダカの鰓において、GFP抗体とAQP3 RNA probeを用いた2重染色を行う。V2bRについては、mRNAの組織発現分布より、脳、鰓、胆嚢、腎臓での発現が高いので、これらの組織に焦点をあてて形態学的、分子生物学的解析により野生型とKOの表現型を比較していく。ツメガエルでの受容体ノックアウト作成については発生の遅いツメガエルの系統を用いてゲノム編集を再度試みる予定である。
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