2018 Fiscal Year Research-status Report
Studies on the response to cold stress in cellular functions and morphology of blood cells and hematopoiesis in amphibia
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17K07476
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
加藤 尚志 早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 教授 (80350388)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 圭 早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 助手 (80779108)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 造血 / 両生類 / アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル / 環境ストレス / 血球 / 造血因子 / 環境温度 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
無尾両生類ツメガエルを低温に暴露すると末梢の赤血球，栓球，白血球の数は急激に減少し，汎血球減少症を呈する特異な現象がある。第2年度では，特に低温曝露栓球減少症モデルに着目し，第1年度に電子顕微鏡観察などで確認した栓球と血管内皮細胞の接着を調べるにあたり，現時点でアフリカツメガエル血管内皮細胞を生体から取り出してin vitro試験をするには種々の問題があったため，血管内皮由来のXLgoo細胞細胞株の単層培養上に，末梢栓球を22℃と５℃とで共培養した。XLgoo細胞に付着した栓球数は、5℃では約１０倍増加しTa。in vitro低温曝露細胞培養系における両細胞の低温刺激依存性に変動する分子群を網羅的プロテオミクスで解析した結果，XLgoo細胞中のプロテオームでは22℃に対して5℃では、201蛋白質分子の量比の上昇を認めた。遺伝子オントロジー解析により、これらの蛋白質分子は細胞間接着、カルシウムイオンに対する応答、および細胞骨格構成に関連していた。同時に，血小板活性化に寄与していることが明らかになった。これらのうち，αチューブリンおよびβアクチンを免疫染色し，XLgoo細胞の腫脹形態変化をさらに確認した。また，高濃度のカルシウムイオン存在下，栓球およびXLgoo細胞それぞれで細胞内へカルシウムの取り込みが上昇し，栓球は低温刺激によってアンチトロンビン非依存的なXLgoo細胞への接着性を増すことを確認した。これらのことより，低温曝露による末梢栓球数の減少の機序は，栓球，血管内皮細胞の双方で細胞内カルシウム上昇を伴う両者の接着性の亢進が一因であることが判明した。
また，アクリジンオレンジで超生体染色したアフリカツメガエル末梢血球をフローサイトメトリーに進め，機械計測による血球鑑別・計数法を確立した。有核血球の解析手段として重要な進展であり，発表論文は早くも海外論文で引用された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
網羅的プロテオミクスで獲得したデータについて，ジーンオントロジー解析，パスウエイ解析に進めることができた。しかしながら，これら一連のin silico解析は，いずれも哺乳類の分子機能データセットを単純に分子構造のホモロジーからアフリカツメガエルへ割り当てて解析結果を導く手法を取らざるを得ないため，実験的検証を進めなければならない。当初の予定では，低温曝露で誘導される分子に対する抗体の利用などを考えていた。しかし，カルシウムイオン輸送の取り込みを引き起こす特定の分子経路は現在のところ明らかではなく，分子機序の解明に関する結論を導くためには，今ひとつ工夫を要する課題があることを認識するに至り，第3年度に向けて取るべき手段を模索中である。しかしながら、アフリカツメガエルを利用する本モデルは、環境変動で誘発される血小板減少症の病態生理学に貢献する手応えを得たことが大きな収穫である。
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| Strategy for Future Research Activity |
現時点で浮上している課題と将来展開について記す。
【遺伝子改変動物の作出】 当初の研究計画にある通り，第三年度に進むにあたり，最大の難関は，末梢循環血球（赤血球，栓球，白血球）のin vivoにおける組織局在性の変化とその動態を直接観察する手段を手中にすることである。遺伝子改変モデル作出に関して，アフリカツメガエルに比して，ナショナル・リソースプロジェクト（NBRP；広島大学両生類研究センター）から供給を受けることができるネッタイツメガエルは，より有利な動物種であると考えられるが，低温耐性が弱く，予備実験では低温曝露による末梢血球数の低下を確認しながらも，１０℃以下の飼育温度に耐えることが難しいことが示された。また，本研究では成体ツメガエルをモデルにしており，発生以降，成体にまで成長する日数を要する問題がでる。このため，環境温度変動に対する造血・血球の応答の比較生物学的解析を可能にすべく，血球特異的な遺伝子蛍光標識をもつメダカ（NBRP；国立基礎生物学研究所）の作出を並行させることにした。これは本研究課題で予定していた遂行内容からの派生であるが，オミクスから得られる仮説を検証するために，メダカとツメガエルのモデルのそれぞれの利点を活かし，相互に補完させることを試みたい。
【オミクスの課題】 昨年度にも記載したとおり，依然としてアフリカツメガエル分子をヒトやマウスのオルソログ分子に読み替え，エルゼビア社のPathwayStudioや，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG；京都大学）による哺乳類のパスウエイ解析を利用している。このため，ツメガエル実験で抽出された分子機能の実検証が不可欠である。ゲノム編集や抗体作出などを摘要するにしても，短期間で結論を得るための実験系の構築に挑戦する必要がある。
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[Journal Article] Flow cytometric analysis of Xenopus laevis and X. tropicalis blood cells using acridine orange2018
Author(s)
Kei Sato, Azusa Uehara, Sayaka Kinoshita, Ikki Nomura, Minami Yagi, Yuta Tanizaki, Yu Matsuda-shoji, Atsushi Matsubayashi, Nobuyasu Endo, Yutaka Nagai, Takashi Kato
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 8
Pages: 16245
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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