2017 Fiscal Year Research-status Report
動原体構築に必須な細胞周期に依存したセントロメアクロマチン形成機構の解明
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17K07501
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
堀 哲也 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (70550078)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | セントロメア / クロマチン / 染色体 / エピジェネティックス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ニワトリDT40細胞を用いて、細胞周期に依存したセントロメアに特異的なヒストン修飾およびクロマチン構築因子の同定を行い、それらを通じてセントロメアクロマチンの構築と維持の分子メカニズムの解明を目指している。平成29年度において、以下3つの項目について研究を行った。
1) ニワトリDT40細胞を使用し、内在性のM期進行に関与するリン酸化酵素CDK1遺伝子の欠損細胞株へリン酸化活性部位に変異を入れたCDK1 (CDK1as)を導入し、CDK1as細胞を樹立した。この細胞株を用いて、CDK1asの特異的阻害剤アナログ（1NM-PP1）の添加と除去により、細胞周期を高精度に同調する方法を確立した。
2) CDK1as細胞周期同調法を適用し、細胞周期をG2、M及びG1期に同調した細胞を用いて、各種ヒストン修飾を認識する抗体を用いたクロマチン免疫沈降と次世代型シーケンサーによる解析（ChIP-seq解析）を行った。これまでの解析から、ヒストンH4の5番目と12番目のリジン残基のアセチル化修飾（H4K5ac、H4K12ac）がG1期特異的にセントロメア領域へ集積することが分かった。
3) CDK1as細胞周期同調法により同調した細胞を用いて、各種クロマチン結合タンパク質を認識する抗体を用いたChIP-seq解析を行った。また、抗体の無いクロマチン結合タンパク質については、それら遺伝子を対象にCDK1as細胞へFLAGあるいはGFPタグをノックイン法により導入し、タグ抗体によるChIP-seq解析が適用可能な細胞株の樹立を行った。
4) CENP-Aのセントロメアクロマチンへの取り込みに関与するライセンシング因子KNL2の機能ドメインを明らかにし、セントロメアの位置を規定するモデルを提出した（Hori et al., Dev. Cell, 2017）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究期間中に明らかにする点として「細胞周期に依存したセントロメア領域のヒストン修飾プロファイルの変化」の解明を挙げた。この研究目標に関連して、これまで、M期進行に関与するリン酸化酵素CDK1遺伝子を特有な変異を持つCDK1遺伝子（CDK1as）と置換する遺伝子改変法によりCDK1as細胞株を樹立し、この細胞株を用いて細胞周期を高度に同調可能な方法を構築した。この細胞周期同調法を適用したChIP-seq解析からヒストンH4の5番目と12番目のリジン残基のアセチル化修飾（H4K5ac、H4K12ac）がセントロメアクロマチン上で細胞周期に従って変化する現象を見いだした。これら修飾は細胞周期のG1期におけるCENP-Aのセントロメアへの取り込み過程に必須な修飾であることを既に報告しているが（H26-28基盤C :研究代表者、堀哲也）、今回見出した細胞周期に従って修飾レベルが変化する現象との関連が示唆され、今後の研究の進展が期待される。また、CENP-Aのクロマチンへの取り込みに関与するライセンシング因子KNL2が、CENP-Aと直接相互作用することを見いだし、セントロメアの位置を規定するモデルを提出した（Hori et al., Dev. Cell, 2017）。本成果は、研究目標であるセントロメアのクロマチン構築と維持メカニズムの解明に向けた鍵となる発見である。以上の理由により、概ね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度に構築した細胞周期同調法を適用し、細胞周期特異的にセントロメアへ集積するヒストン修飾およびクロマチン結合因子の検索を継続する。以下３項目について研究を推進する。
1) CDK1as細胞周期同調法により細胞周期の同調を行い、平成29年度において未試験のヒストン修飾を認識する抗体を用いて、ChIP-seq解析を行なう。ヒストン修飾抗体は、東京工業大学の木村宏教授から供与を受け、次世代型シーケンサーによる解析は、国立遺伝学研究所の豊田敦特任教授の協力のもと行ない、得られた大量データの情報解析は、国立遺伝学研究所の池尾一穂准教授の協力を仰ぐ。これら解析により、細胞周期の進行に伴うセントロメアに特異的なヒストン修飾の局在プロファイルを明らかにする。
2) 平成29年度において樹立を行った、FLAGあるいはGFPタグをノックインしたクロマチン結合タンパク質について、タグ抗体によるChIP-seq解析及びChIP実験と高感度質量分析を組み合わせた解析を行う。この実験においても１）と同様に、CDK1as細胞周期同調法を適用し、細胞周期をG2、M及びG1期に同調した細胞に対して行なう。高感度質量分析は、大阪大学の小布施力史教授の協力を仰ぐ。これら解析により、細胞周期の進行に従って変化するクロマチン結合タンパク質の局在プロファイル及び相互作用タンパク質を明らかにする。
3) ヒストン修飾とセントロメアクロマチン結合タンパク質について、上記解析により明らかにした細胞周期における局在プロファイルの比較解析を行う。これらの解析でヒストン修飾との相関関係を見いだしたクロマチン結合タンパク質に焦点を絞り、それら遺伝子破壊株をDT40細胞で樹立する。細胞周期の特定の時期にセントロメア局在性を示す因子を想定し、短時間でタンパク質を分解できる実験系 (AID法) を利用した遺伝子破壊株の樹立を試みる。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由：計画していたクロマチン結合タンパク質のクロマチン免疫沈降実験（ChIP）に向けて、平成29年度においては、FLAGあるいはGFPタグをノックイン法により導入し、タグ抗体によるChIP実験が適用可能な細胞株の樹立を先行して行った。その結果、クロマチン免疫沈降法における生化学実験で使用するFLAGあるいはGFPタグを認識する抗体、免疫沈降ビーズおよび高感度質量分析サンプル調整に必要な各種生化学、分子生物学実験試薬の購入を縮小した。以上の理由により次年度使用額が生じた。
使用計画：平成29年度に樹立したクロマチン結合タンパク質遺伝子へのFLAGあるいはGFPタグをノックインした細胞株を用いて、タグ抗体によるChIP-seq解析及びChIP実験と高感度質量分析を組み合わせた解析を行う計画である。次年度使用額は、クロマチン免疫沈降法における生化学実験で使用するFLAGあるいはGFPタグを認識する抗体、免疫沈降ビーズおよび高感度質量分析サンプルの調整に必要な各種生化学、分子生物学実験試薬の購入に使用する計画である。
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