2018 Fiscal Year Research-status Report
哺乳動物ミトコンドリアＤＮＡの塩基修飾の解明～その生物学的意義の理解にむけて
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17K07504
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
安川 武宏 九州大学, 医学研究院, 助教 (90646720)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ミトコンドリアＤＮＡ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞小器官ミトコンドリアは別の独自のゲノム、ミトコンドリアDNA（mtDNA）を持つ。mtDNAに生じた塩基置換や部分欠失、コピー数低下といった異常がミトコンドリア病の原因となったり、様々な疾患に関与している。それ故、mtDNA異常が関わる疾患を分子レベルで把握し、新しい治療法を創出していくためにmtDNAのふるまいをよりよく理解していくことが重要である。哺乳動物細胞において核DNAの構成塩基の1つであるシトシンのメチル化はエピジェネティックな遺伝子発現制御において重要な役割を果たしており、初期発生や細胞の分化状態の維持に必須である。一方で、mtDNAのメチル化の研究は大きくたち遅れていたが、mtDNAはメチル化されているという報告が近年相次いでなされ、ミトコンドリア研究のhot topicsの1つとなっている。しかしながら、これらの報告の中には互いに異なる内容のデータを示しているが見受けられ、さらにはmtDNAはメチル化を受けていないと提唱する報告もあり、非常に混迷した状況が続いている。mtDNAがメチル化修飾を受けるか否かはmtDNAの適切な維持や遺伝子発現を考える上で重要かつ根源的な生物学の課題であり、その異常がミトコンドリア病をはじめとした疾患に関連する可能性も秘めている。そこで我々はバイサルファイトシーケンシング、メチル化シトシン感受性酵素、核酸質量分析という解析手法を駆使して、マウス組織、胚性幹細胞培養株のmtDNAの徹底的な解析を行った。これらの解析からmtDNAにはユニバーサルに生理的役割を持つようなレベルでの5‐メチルシトシンは認められないことを示唆する結果を得た。加えて、正確なメチル化解析を困難にするmtDNAに特有の問題点を観察した。これらの成果によってシトシンメチル化修飾についてのmtDNAの真の姿の一端を明らかにしつつあるのではと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々はバイサルファイトシーケンシング法、メチル化シトシン感受性酵素McrBCによる切断アッセイ法、定量的核酸質量分析法という、3つの異なる原理に基づいた5-メチルシトシン（5mC）検出方法を用いて、正常マウスの肝臓と脳、そして野生型ES細胞株のmtDNAを徹底的に解析した。バイサルファイトシーケンシング法では有意に5mCは検出されず、5mCが特異的に存在するmtDNA内の領域や配列特異性が特定されなかった。そして、McrBCによってmtDNAは分解されかったことから、mtDNAに5mCは存在していない、あるいはたとえ存在していたとしても非常に微量であることが分かった。さらに、高純度に精製したmtDNAを質量分析法で解析したところ、やはり5mCはほとんど検出されなかったが、定量的には未修飾のシトシンに対しておよそ0.4％というごく微量ではあるが5mCが検出された。3つの実験の結果を総合的に解釈して、ここまでの研究で解析したサンプル（マウス組織、ES培養細胞株）においては、mtDNAがメチル化修飾を受けていない、あるいは、少なくとも生物学的役割を果たすようなレベルで５mCは存在していないと結論し報告した。ここまでの結果から、質量分析で検出した5mCに生理的意味があるのかという点が本研究における次の論点であると考え至った。そして質量分析で検出した極微量の5mCがmtDNA複製の過程で取り込まれているという新しい可能性を想起し、この事象を検討する実験を遂行している。また、5mCが環状DNA（mtDNAは環状DNA）に対するmtDNA結合タンパク質の結合力やDNAのトポロジーを変化させる特性に影響を与えるかどうかを検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）前項目で提示した正常mtDNA複製における5mCの取り込みの可能性についての定量的な検討を進めて結論を得たいと考えている。
（２）前項目で論じたように、DNAメチル化修飾というものは通常の組織や通常条件で培養した細胞のmtDNAに対しては機能していないとみなしてよいと考えることができる。しかしながら、核DNAをメチル化するDNAメチル化酵素が一部ミトコンドリアにも局在することを示唆する報告がされており、mtDNAの転写や複製を短期間急激に不活性化させるような状態が必要なときにmtDNAが酵素的に有意にメチル化される可能性は否定できない。そこで、特殊な条件下や特殊な状況の細胞等を用いてmtDNAメチル化の有無の解析を進めていく予定である。そして、mtDNAがメチル化されるような事象をとらえることができたら、その生理的意義や機能を追求していく予定である。
（３）加えて、mtDNA維持機構という課題をより大きな視点からとらえた実験も行いたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
（理由）
研究を進めていくにあたり、必要な物品購入にかかった費用が予定よりも下回ったためです。
（使用計画）
研究を滞りなく進めるために、物品費、旅費、または必要が認められればその他の費用として使用させていただきたいと考えております。
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[Presentation] Accurate estimation of 5-methylcytosine in mammalian mitochondrial DNA2018
Author(s)
Yasukawa T, Matsuda S, Sakaguchi Y, Ichiyanagi K, Unoki M, Gotoh K, Fukuda K, Sasaki H, Suzuki T, Kang D
Organizer
YoungMito2018, The 1st International Mitochondrial Meeting for Young Scientists
Int'l Joint Research / Invited
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[Presentation] Accurate estimation of 5-methylcytosine in mammalian mitochondrial DNA ~ Does cytosine modification occur to mtDNA?2018
Author(s)
Matsuda S, Yasukawa T, Sakaguchi Y, Ichiyanagi K, Unoki M, Gotoh K, Fukuda K, Sasaki H, Suzuki T, Kang D
Organizer
YoungMito2018, The 1st international mitochondrial meeting for Young Scientists
Int'l Joint Research
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