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2018 Fiscal Year Research-status Report

Molecular Evolution of diverse RNA kinase family proteins and construction of mutant enzymes based on the evolutionary data

Research Project

Project/Area Number 17K07517
Research InstitutionKeio University

Principal Investigator

金井 昭夫  慶應義塾大学, 環境情報学部(藤沢), 教授 (60260329)

Project Period (FY) 2017-04-01 – 2020-03-31
KeywordsRNAキナーゼ / 分子進化 / 系統樹 / 機能ドメイン / 実験検証
Outline of Annual Research Achievements

Clp1は真核生物で見出されたPolyribonucleotide 5'-hydroxyl-kinaseである。また、Clp1のアミノ酸配列と類似したNol9やGrc3が真核生物の一部に存在する。その一方、これらのClp1 familyタンパク質がいかに進化し、多様化していったのかに関する知見は限られている。本研究は生物の3ドメインを構成するバクテリア、アーキア、真核生物ゲノムを対象として大規模な分子進化解析を実施すると共に、特に原核生物では完全長ゲノムが報告されている生物種に対し、系統学的な分布および頻度解析をおこなった。
結果、Clp1相同タンパク質として3,557件が得られたが、この中には、これまで知られたアーキアや真核生物に由来するものばかりでなく、系統的には分散しながら、限定されたバクテリアに由来するものが少数存在していた。これらClp1相同タンパク質は、生物の3大ドメインの生物種にそれぞれ特有な構造ドメインを有したかたちで多様化していることが明らかとなった。また、Clp1関連タンパク質の配列長は平均約555アミノ酸長であったが、驚いたことに、Clp1 polynucleotide kinase domainを含有した1,000アミノ酸残基以上)の巨大タンパク質が真核生物に122件同定された。これらは新規のマルチドメインタンパク質であった。さらに、バクテリアThermus scotoductus 由来のClp1タンパク質(Ts-Clp1)を用いて、そのリン酸化活性を実験的に解析した。Ts-Clp1は1本鎖RNAオリゴを優先的にリン酸化したが (Km 6 nM)、酵素濃度を高くしてやれば、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドもリン酸化の標的とした (Km 130 nM)。Ts-Clp1は極めて耐熱性で、90℃においてもその活性を示した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上記のように考えた理由は、申請段階では全くわからなかった2つの事象を明らかにできたからである。
(1)バクテリアでのClp1該当分子の発見と、世界初となるポリヌクレオチドキナーゼ活性の実験的な検証をおこなったこと。
(2)Clp1 polynucleotide kinase domainを含有した巨大タンパク質の一群を発見したこと。
その一方で、当初計画したキメラ分子を用いて、機能性ドメインの構造活性相関を行う計画を変更せざるを得なかった。この問題に関しては将来の課題として考えている。

Strategy for Future Research Activity

大まかな分子進化研究は終わっているので、情報学的な解析によって見出したバクテリアClp1の実験検証を再確認すると共に、本研究を国際学術雑誌にまとめる方向で、最終年度の総まとめを行いたい。

Causes of Carryover

2018年度において検証実験が終わらなかったために、少額であるが、ある程度の消耗品や薬品を購入する研究費を2019年度に残すため。

  • Research Products

    (5 results)

All 2018

All Presentation (5 results)

  • [Presentation] Large-scale phylogenetic analysis and diversity of Clp1 polynucleotide kinase family protein2018

    • Author(s)
      M. Saito, A. Sato, S. Nagata, M. Tomita, S. Tamaki, H. Suzuki, and A. Kanai
    • Organizer
      RNA 2018: The 23rd Annual Meeting of the RNA Society, University of California Berkley, USA.
  • [Presentation] 生命の起源と原始生命に関わる研究戦略2018

    • Author(s)
      金井昭夫
    • Organizer
      日本進化学会年会シンポジウム 「地球の歴史と生命の起源、生命を構成する分子の進化」日本進化学会第20回大会 東京
  • [Presentation] RNAキナーゼClp1の大規模分子進化解析から予測された新規バクテリアClp1の機能検証2018

    • Author(s)
      齋藤元文、佐藤朝子、永田祥平、玉木聡志、冨田勝、鈴木治夫、金井昭夫
    • Organizer
      第2回 慶應ライフサイエンスシンポジウム 日吉
  • [Presentation] Biochemical characterization of a novel and thermostable polynucleotide kinase Clp1 in the thermophilic bacterium Thermus scotoductus.2018

    • Author(s)
      M. Saito, A. Sato, S. Nagata, M. Tomita, S. Tamaki, H. Suzuki, and A. Kanai
    • Organizer
      International workshop on “50th anniversary of Thermus thermophilus discovery” Izu, Japan
  • [Presentation] 好熱性バクテリアThermus scotoductus由来新規ポリヌクレオチドカイネースClp1の生化学的な特徴解析2018

    • Author(s)
      齋藤元文、佐藤朝子、永田祥平、冨田勝、玉木聡志、鈴木治夫、金井昭夫
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会 横浜

URL: 

Published: 2021-01-27  

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