2017 Fiscal Year Research-status Report
哺乳類の季節繁殖の性差：RNAseqを用いた遺伝的基盤と多様化の仕組みの解明
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17K07537
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
坂本 信介 宮崎大学, 農学部, 講師 (80611368)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石庭 寛子 福島大学, 学内共同利用施設等, 特任助教 (00624967)
大沼 学 国立研究開発法人国立環境研究所, 生物・生態系環境研究センター, 主任研究員 (50442695)
續木 靖浩 宮崎大学, 農学部, 教授 (00236928)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 季節繁殖 / 光周性 / 温周性 / 雌雄差 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類は光周性の遺伝的仕組みを共有するが、光周性が制御する季節応答には性差や個体差がある。申請者は、日本固有種のアカネズミが哺乳類で最も多様な繁殖期を持つことに着眼し、環境温度が繁殖に与える影響が雌雄で異なる可能性を見出してきた。さらに分担者らはアカネズミの全ゲノムを明らかにした。そこで本研究では、温度への応答に性差があるとの仮説のもと、RNAseqによる網羅的遺伝子発現解析を用いて、アカネズミの季節繁殖を制御する遺伝的基盤と繁殖期が多様化する仕組みを解明する。
網羅的遺伝子発現解析に供する解析対象サンプルや解読範囲を少しでも絞り込むため、まず1年目であるH29年度には日長と環境温度に対する雌雄の繁殖応答について表現型解析を進めた。その結果、自然光を取り入れた涼しい室内では、本来の繁殖時期である春、秋、冬に加え、非繁殖期の夏にも繁殖できることが明らかとなり、暑熱ストレスによる繁殖抑制が示唆された。
さらに、これまでの研究では、広い室内で雌雄同居時にしか繁殖状態の誘導が思うように進まず、インキュベータを用いた温度制御試験に成功していなかった。そこで検討を重ねた結果、異性の飼育ケージから床材を定期的に供給し、異性由来の性的刺激を与えることで、雌雄ともにインキュベータ内での単独飼育時に繁殖状態を誘導できる飼育試験方法を確立した。この方法によって、繁殖に不適だと考えられる環境温度域では、メスの繁殖状態が悪くなるが、オスではそのような反応はみられないか、みられた場合も遅れて生じることが明らかとなった。これらはメスの応答性が高いことを示唆する予測どおりの結果であったが、個体差が大きく評価しづらい現象であるため、反復試験を継続している。
また、野外で個体の体温変動をモニタリングすることで、繁殖期の開始時期を明確にすることができた。
以上の成果について学会発表で講演した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
網羅的遺伝子発現解析には高額の費用を要するため、あらかじめ解析対象サンプルや解読範囲を絞り込む必要がある。そこで、H29年度には、日長と環境温度に対する雌雄の繁殖応答について表現型解析を進めた。その結果、自然光を取り入れた涼しい室内では、非繁殖期の夏にも繁殖できることが明らかとなった。これは日長と環境温度に対する本種の繁殖応答を考察する上で大きな進展である。
これまでの研究では、雌雄同居時にしか繁殖状態の誘導が思うように進まず、日長や環境温度が繁殖に与える影響は、野外調査と半野外施設および飼育室内での同居実験の成果を比較しながら調べてきた。ただし、同居によって対象種を繁殖させるには広いケージでの飼育が必要なことから、インキュベータ内での実験ができず、環境温度変化への応答は詳細に調べられなかった。そこで、単独飼育でインキュベータを用いた繁殖誘導試験の確立を試みたところ、異性由来の性的刺激を与えることで、雌雄ともにインキュベータ内での単独飼育時に繁殖状態を誘導できることがわかった。この方法によって、繁殖に不適だと考えられる環境温度域では、メスの繁殖状態が悪くなるが、オスではそのような反応はみられないか、みられた場合も遅れて反応することが明らかとなった。これらは予測どおりの結果であったが、個体差が大きく評価しづらい現象であるため、反復試験を継続している。以上の実験手法によって、今後、日長や環境温度変化を独立に経験させた個体の繁殖状態を調べられるようになった。また、野外で個体の体温変動をモニタリングすることで、宮崎集団の繁殖期の開始時期・終了時期を明確にすることができた。
以上のように、表現型解析は一部当初計画より進んだが、網羅的遺伝子発現解析については、関連文献の発表が加速しているために、ターゲットとなる候補遺伝子を含む領域の選定や試験方法の確定を慎重におこなうこととした。
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| Strategy for Future Research Activity |
H29年度のインキュベータ内での単独飼育試験によって、環境温度への繁殖応答の雌雄差が観察されているが、これには個体差がみられたことから、試験開始前の飼育環境要因や繁殖状態の微細な個体差が影響を及ぼしていた可能性がある。そこで、試験開始前の環境条件を制御し、完全に非繁殖状態にある個体を用いて、環境温度を良い条件にした時に繁殖が誘導されるか調べる。さらに異性由来の刺激を成熟個体由来と非成熟個体由来の２区に分け提示することで、時期的に先に繁殖状態に移行するのは雌雄のどちらである可能性が高いか調べる。繁殖期の終了が環境温度によって誘導されているかを調べるために、環境温度を悪化させていく条件で同様の実験をおこなう。これに加えて、野外で個体の体温変動をモニタリングすることで、繁殖期の終了時期を明瞭にする。
これまでの実験では、外から非侵襲的に観察できる生殖器官の外貌変化を繁殖兆候の明瞭な指標として用いてきた。しかし、検証すべき環境要因とその条件が絞り込めれば、それに応じて体内で起こる変化を指標にすることで、環境変化への雌雄の繁殖応答をより詳細に調べられる可能性がある。そこで、H30年度には、日長や環境温度の変化に対する性分泌物や内部生殖器の形態や機能の変化を調べる。特に、メスの腟分泌物の性状とオスの精子生産を調べる。
H29年度の成果から、異性由来の刺激を提示しながら同時に光や環境温度の変化を経験させた個体の繁殖状態を評価できる系が確立できたため、これらから網羅的遺伝子発現解析にサンプルを供する。これと並行して、H30年度には、野外集団からのサンプリングを実施する。宮崎集団および真逆の繁殖季節を持つ高標高地域集団から個体を採集し、網羅的遺伝子発現解析にサンプルを供する。
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| Causes of Carryover |
本課題では、網羅的遺伝子発現解析とそれに必要な野外サンプル採集のための調査旅費に予算の多くを割く必要がある。これらには高額の費用を要するため、あらかじめ解析対象サンプルや解読範囲、調査時期を絞り込む必要がある。
遺伝子発現解析については研究開始当初の時点では、候補遺伝子の選定が難しい状況であったが、関連分野の進展が目覚しく、文献の発表が加速していた。そのために、候補遺伝子を含む領域の選定や試験方法の確定を次年度に先延ばしし、慎重におこなう方がリーズナブルであった。一方で、本課題の野外サンプリングについては、特定の繁殖パターンを持つ繁殖集団から、解析に適した繁殖状態の個体をタイミングよく採集する必要がある。知己の研究者からの情報で、H29年度は当初予定していた調査地の野ネズミの個体数密度が低いことがわかった。対費用効果が望めないために、個体数が回復するまで待つこととした。この点からも、遺伝子発現解析は先延ばしにした方が良いと決断した。
以上の理由で、H29年度は当初困難だと考えていたために後回しにする予定であった単独飼育での繁殖誘導を試み、予想より良い成果を得た。この試験に必要な予算の一部は他の研究費で賄えたため、本研究費は次年度以降の解析に回すために積極的に残した。そのために次年度使用額が生じたが、次年度の解析に必要不可欠であり、サンプル採集後速やかに執行する計画である。
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