2017 Fiscal Year Research-status Report
Molecular genetic basis of plasticity evolution of the inducible defence in the water flea Daphnia pulex
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17K07558
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
宮川 一志 宇都宮大学, バイオサイエンス教育研究センター, 准教授 (30631436)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ミジンコ / 周期性単為生殖 / 誘導防御 / 表現型可塑性 / 反応規準 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生物が環境に応じて表現型を様々に作り変える表現型可塑性は種の繁栄に貢献するすぐれたシステムであり、その分子制御機構がさかんに研究されている。一方で、表現型可塑性を担う因子がゲノム上にどのように分布し、またそれらが世代を経てどのように遺伝し可塑性の進化をもたらすのかといった分子遺伝基盤についてはほとんど解明されていない。本研究ではミジンコの持つ周期性単為生殖という性質を利用した交配実験によってミジンコの示す可塑性がどのように次世代に遺伝するかを明らかにし、さらには戻し交配と連鎖解析によって可塑性の変化や維持に関与するゲノム領域を決定することを目的とする。これらの研究によって、生物の巧みな環境応答がどのようにして進化したかという生物学における普遍の問題を解明することが可能となる。
本研究はまず、可塑性の異なるW系統とM系統を用いた交配実験によって「①表現型可塑性の遺伝様式」を解析することから始まる。続いて①で作成したF1系統群に対し全ゲノム連鎖解析および遺伝子機能解析を行うことで「②表現型可塑性の分子制御機構」を明らかにする。また②と並行し、F1系統群から特徴的な可塑性を示す系統を選抜しW系統に戻し交配を繰り返すことで表現型可塑性の人為的な進化を誘導する「③表現型可塑性の進化にともなうゲノム進化過程」の解析を開始する。そして最後に、これらの飼育系統を用いた室内実験の結果が実際に自然界でも成り立つものであるかを、新たに採集した野外系統と比較解析することで明らかにし、「④表現型可塑性の進化を担う分子遺伝基盤」の統合的な理解へとつなげることを目標とする。
平成２９年度はまず「①遺伝様式の解析」に関して、M系統とW系統を交配させたF1世代系統の作成を行った。さらに、作成したF1系統の、カイロモンの濃度に応じた表現型の変化パターン（反応規準）を解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ゲノム解析を行うための基礎データとして、ロングリード次世代シークエンサーPacBio RSⅡを使用してミジンコゲノムのde novo構築を行った。
W系統とM系統を使用し、有性生殖卵と予想される休眠卵の産生を効率的に誘導する飼育系の確立に成功した。また、有性生殖の確認には高解像度融解曲線（HRM）解析を用いるが、それに使用する最適なプライマーの設計に成功した。これらを用いて両者のF1系統を1系統作出することに成功した。
作出されたF1系統および両親であるW系統とM系統に対し、様々な濃度のカイロモンを暴露し反応規準を比較したところ、F1系統はW系統とM系統の中間的な可塑性を示すことが明らかになった。両親の可塑性がF1系統に遺伝したことが予想されたとともに、表現型可塑性の遺伝学実験を行うための基盤が確立できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２９年度の研究により、周期性単為生殖ミジンコを使用した遺伝学が実現可能なものとなった。平成３０年度は「②分子制御機構の解析」および「③ゲノム進化過程の解析」に向け、RAD-seqによるゲノム解析を中心的に行う。
「②-Ⅰ F1世代系統群のRAD-seqによる可塑性の責任ゲノム領域の推定」 まず、平成２９年度に作成したF1系統に雄を誘導し、F1系統同士による近親交配を行うことでF2近交系統群を作成する。これらF2系統群の示す防御形態形成の反応規準では、祖父母であるM系統とW系統の持つ遺伝子型が分離することで様々なバリエーションが生じることが予想される。このF2系統群の多様な可塑性のバリエーションがゲノム上のどの領域に依存しているかということを、次世代シークエンサー（NGS）を使用したRAD-seqによる連鎖解析によって明らかにする。NGS解析は専門的な技術を持つ研究協力者である宇都宮大学の鈴木智大准教授の協力のもと行う。
「②-Ⅱ 責任ゲノム領域の機能推定・解析」 ②－Ⅰで得られた候補領域が実際にミジンコの表現型可塑性に影響を与えているかを遺伝子機能解析によって明らかにする。これらの候補領域の機能はマイクロインジェクション法によるCRISPR/Cas9システムによって解析するが、特に候補領域に遺伝子がコードされている場合はRNAi法も併用する。実際に実験を行う際にはミジンコの全ゲノム配列情報が必須となる。材料であるミジンコは既に全ゲノム配列が公開されているが、このデータには不完全な部分やアセンブリ・アノテーションのエラーが多数含まれているため、平成２９年度に自ら作成したゲノム配列情報も利用する。
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