2018 Fiscal Year Research-status Report

自発的な胚発生誘導システムを搭載した植物遺伝子組換えベクターの開発

Research Project

Project/Area Number	17K07600
Research Institution	Chiba University
Principal Investigator	井川智子千葉大学, 大学院園芸学研究科, 准教授 (00360488)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	胚発生 / 植物体再生 / 遺伝子組換え
Outline of Annual Research Achievements	植物の遺伝子組換え技術は、基礎研究においては遺伝子機能解析を、応用研究においては新形質の付与を可能とするなど、植物科学研究の発展には極めて重要な技術である。しかし多くの植物種では遺伝子組換えを可能にする適切な条件を設定することが難しい。本研究は、細胞からの植物体再生系確立における障害を克服するために、遺伝子導入用ベクターに自発的に不定胚形成を誘導する遺伝子を座乗させ、目的遺伝子導入と植物体再生を可能にする基盤システムを構築することを目的としている。前年度までに、シロイヌナズナ由来のBabyboom (BBM)遺伝子を用い、タバコへ導入して一過的発現による効果を調査した結果、植物体再生にプラスの効果をもたらさなかった。そこで当該年度においては、さらに別の胚発生関連遺伝子であるLEC1,WIND,WUS遺伝子を採用することにした。まずこれらの遺伝子をすべてシロイヌナズナよりクローニングし、遺伝子導入用ベクターに座乗させた。その際に、BBMを基本としてLEC1,WIND,WUSをそれぞれ追加した発現コンストラクトとした。さらに、BBMともう一つの胚発生遺伝子は、両方向の転写を行うMASプロモーターによって転写が制御されるデザインとした。当該年度ではまずBBMとLEC1を組み合わせた遺伝子発現カセットを、アグロバクテリウムを介してタバコ葉組織に導入した。その結果、コントロールとして比較して植物体再生においてネガティブな効果を示した。しかしホルモンに対する感受性が異なる結果となり、胚発生関連遺伝子と植物ホルモン間の関係性を示した。次年度は、別の胚発生関連遺伝子間とBBMの効果を検証しつつ、植物体再生に正の効果をもたらす条件を明らかにし、システムの構築を目指す。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では胚発生に関与する転写因子であるシロイヌナズナのBBMおよびLEC1を利用し、BBMのみを発現、またはBBMおよびLEC1 を同時に発現させる遺伝子発現カセットを組み込んだバイナリーベクターを作製した。これらバイナリーベクターをアグロバクテリウムEHA105株に導入し、タバコ葉切片に接種して、影響を調査した。タバコで最適なシュート再生条件 (NAA 0.1 mg/L, BA 1.0mg/L) においてはBBM を導入した影響は見られなかったが，培地中のBA 濃度を低下させたときに，BBM の再分化頻度上昇の影響が見られた。この結果からBBM が再分化におけるサイトカイニン作用経路に関与している可能性が示唆された．またBBM・LEC1を同時発現させたタバコの葉切片では再分化が著しく抑制され，再分化におけるタバコの内在性ホルモン作用経路に負の効果をもたらしたと考えられた。そこで別の胚形成関連遺伝子WUSを用いて，更なる解析を行うために、BBMとWUSを同時発現させるバイナリーベクターの構築に着手した。
Strategy for Future Research Activity	本年度は、BBM単体の遺伝発現カセットをコントロールとして、転写活性因子を付加したBBM遺伝子発現カセットおよびBBMおよびWUSを同時発現する遺伝子発現カセットを完成させ、タバコ葉切片へのアグロバクテリウム接種により導入する。さらに導入後の培養条件を検討し、各胚発生遺伝子の影響とホルモンの関係を明らかにすると共に、胚発生遺伝子を導入することで不定胚または不定芽分化が促進されるかについて評価する。
Causes of Carryover	実験は概ね計画通りに進んでいるが、BBMの効果が当初期待されたほどの胚発生促進効果を示さなかった。そのため、組換え体の分子解析よりも、令和元年度にかけてはさらに別の胚発生関与遺伝子を用いて効果を検証することを優先する方針とした。そのため、令和元年度では新たに遺伝子クローニングに係る費用およびベクターが完成した後の接種試験に係る消耗品類が必要となる。また、今年度は組換え体の分子解析も行う予定である。以上の理由から、令和元年度において十分な開発実験をするために、次年度使用額として処理し、研究に使用することとした。