2017 Fiscal Year Research-status Report

牧草・芝草におけるゲノム編集による新たな育種技術の基盤構築

Research Project

Project/Area Number	17K07608
Research Institution	University of Miyazaki
Principal Investigator	権藤崇裕宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 助教 (10437949)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ゲノム編集 / 遺伝子組換え / 暖地型イネ科牧草 / バヒアグラス / 不定胚
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、牧草・芝草におけるゲノム編集による新たな育種を展開するため、確立してきた遺伝子組換え手法を用いて、実用化に向けた育種技術を開発することが目的である。また、ゲノム編集技術の中でも、DNAベクターをゲノムに組込まずに、パーティクルガン法により細胞内に導入し、その一過的発現を利用してゲノム編集を行う実験系（TransGene(TG)-freeのゲノム編集法）を構築する。本年度は、①TG-freeのゲノム編集において、カルスに形成される不定胚に着目し、それを標的組織として用いる際の培養法について検討した。バヒアグラスのエンブリオジェニックカルスを用い、不定胚のみを摘出し、様々な培地で培養条件を検討したところ、不定胚より二次的な不定胚が連続的に形成される培養系を確立した。また、この不定胚を用いて、パーティクルガン処理を行ったところ、多くのGUS遺伝子の一過性発現が認められ、本培養法がTG-freeのゲノム編集に十分適応できるものと考えられた。次に、②消化性に関連するリグニン生合成遺伝子として、CAD遺伝子とCOMT遺伝子を標的にバヒアグラスよりcDNAを単離し、それらの発現解析を行った。単離したバヒアグラスのCAD遺伝子とCOMT遺伝子の塩基配列は、イネ科の中でも同じC4植物と高い相同性を示した。また、これらの遺伝子についてリアルタイムPCRによる発現解析を行ったところ、異なる生育段階での植物組織における遺伝子の発現は、どちらも出穂後期で高くなる傾向が認められ、リグニン含量においても同様な結果であった。このことから、今回単離したバヒアグラスのCAD遺伝子とCOMT遺伝子は、リグニン生合成に深く関与していることが明らかとなった。現在、これらの遺伝子の配列情報よりガイドRNAを設計し、ゲノム編集ベクターを作成している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初計画していた不定胚の培養法の確立および標的遺伝子の単離とゲノム編集ベクターを構築することができ、本年度の研究はおおむね順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	現在、構築した編集ベクターを用いて、不定胚へTG-freeのゲノム編集を行っており、それと並行して、カルスへの遺伝子組換えを行っている。TG-freeのゲノム編集では、当代で編集個体を選抜し、カルスを用いた遺伝子組換えでは、後代まで展開して、ベクターが除かれた編集個体を選抜する。
Causes of Carryover	本年度は、研究期間の１年目であり、研究を遂行することを優先して、予定していた学会に出席しなかった。次年度は、論文投稿料および学会出席費で使用する予定である。