2018 Fiscal Year Research-status Report

牧草・芝草におけるゲノム編集による新たな育種技術の基盤構築

Research Project

Project/Area Number	17K07608
Research Institution	University of Miyazaki
Principal Investigator	権藤崇裕宮崎大学, フロンティア科学実験総合センター, 助教 (10437949)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ゲノム編集 / 遺伝子組換え / 暖地型イネ科牧草 / バヒアグラス / シバ / 不定胚
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、牧草・芝草におけるゲノム編集による新たな育種を展開するため、確立してきた遺伝子組換え手法を用いて、実用化に向けた育種技術を開発することが目的である。また、ゲノム編集技術の中でも、ベクターをゲノムに組込まずに、パーティクルガン法により細胞内に導入し、その一過的発現を利用してゲノム編集を行う実験系（TransGene(TG)-freeのゲノム編集法）を構築する。本年度は、前年度単離したリグニン生合成遺伝子であるCAD遺伝子の塩基配列より、ガイドRNAを設計し、実際にバヒアグラスの不定胚に導入し、一過性の発現によるゲノム編集を試みた。ベクター導入後、培養10日目の不定胚を用いてHMA解析を行ったところ、ヘテロ二本鎖の形成による電気泳動の移動度の違いが認められ、細胞レベルで変異が誘発されていることを確認できた。その後、不定胚より再分化した植物体500個体を用い、変異の有無を確認したところ、標的配列における塩基の欠失は認められず、ゲノム編集された変異体の獲得には至らなかった。今後は、数カ所でガイドRNAを設計して最も効率的に編集できる配列を探索し、これまでと同様に一過性の発現によるゲノム編集行うと同時に形質転換体を獲得し、編集個体を獲得する。次に、コウシュンシバにおけるゲノム編集を行うため、その第一段階である形質転換系の確立を試みた。アグロバクテリウム法における形質転換条件を検討したところ、カルスへの感染および共存培養でのアセトシリンゴン濃度は100μM、共存培養日数は7日間が最も効率的であった。84個のカルスを供試して形質転換を行ったところ、4つの形質転換カルスが得られ、それらより植物体が再生した。現在、ゲノム編集により除草剤耐性形質を付与するため、ALS遺伝子をターゲットにベクターを構築している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason バヒアグラスでは、当初計画していたゲノム編集個体の獲得には至っておらず、いくつかの課題が挙げられた。一方、シバでは形質転換系を確立し、ゲノム編集を進めており、本年度の研究はおおむね順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	バヒアグラスでは、gRNAの設計からやり直し、一過性の発現によるゲノム編集および形質転換体を獲得する方法の両方向より研究を進める。シバに関しては、アグロバクテリウム法により形質転換体を獲得し、そこから変異体を選抜する。
Causes of Carryover	当初計画していた物品を購入する必要が無くなったため、次年度使用額が生じた。次年度は、論文投稿料および学会出席費で使用する。