Analysis of epigenomic regulation mechanism in picotee formation of worldwide marvelous camellia 'Tamanoura'

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07643
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 尾崎 行生 九州大学, 農学研究院, 准教授 (60253514)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水ノ江 雄輝 九州大学, 農学研究院, 助教 (50759206) ; 増田 順一郎 宮崎大学, 農学部, 准教授 (60452744)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ツバキ / 覆輪形成 / エピゲノム制御機構 / 環境

Outline of Annual Research Achievements

まず，CHS遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を決定するために，アダプターPCR法を実施した．制限酵素 DraI，EcoRV，PvuII，StuIで消化した‘玉之浦’のゲノムDNAを用いて，アダプター配列特異的プライマーとCHS遺伝子配列特異的プライマーでPCRを行った結果，PvuIIで消化したDNAでのみ2つのバンドが検出された．さらに，それぞれのPCR産物でNested PCRを実施したところ，PvuIIでのみ約3400bpと約2900bpにバンドが検出された．
次に，花芽発達期の低温処理が覆輪形成に及ぼす影響について調査した．11月10日（花蕾内の花弁着色開始期）以降の全期間を20℃ファイトトロンで栽培した場合に，覆輪割合が最も大きかったのに対し，11月10日から1か月および3か月の低温処理を行った後に20℃ファイトトロンで栽培すると覆輪割合が小さかった．花弁着色が進行したと思われる1月10日から1か月間の低温処理を行っても覆輪割合が大きかったことから，1月上旬までに覆輪幅は決定されており，その後の低温によって変化することはないことが示唆された．
温度と光が覆輪形成に及ぼす影響を明らかにするため，in vitroで花弁培養を行った．花蕾を採取し，向軸側から3枚の花弁を取り出して，15℃，20℃，25℃の明条件および25℃の暗条件下で10日間の10％ショ糖溶液による培養を行った．培養後はいずれの処理区でも花弁幅は広くなり，温度が高い方がより広くなる傾向にあった．また，15℃および20℃では覆輪幅が狭まったが，25℃では培養前後に有意な差は認められなかった．花弁幅に対する覆輪幅の比は花弁培養後に小さくなる傾向にあったが，処理区間での明確な比率の差異は認められなかった．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

いずれの実験も概ね計画通りに進捗しており，引き続き計画通りに研究を進める予定である．

Strategy for Future Research Activity

プロモーター領域の塩基配列を決定するために，ゲル抽出によって得られたPCR産物を用いてダイレクトシークエンス解析を行う．配列決定後，花弁の白色部位と赤色部位から抽出したDNAを使用し，バイサルファイト法により白色部位と赤色部位におけるメチル化程度を比較する．
花蕾内の花弁着色初期の温度処理による覆輪幅の制御が可能であることが判明したことから，この実験系を使って花弁外縁部と地色部におけるCHS遺伝子の発現量およびメチル化程度の比較を行う．
In vitro実験では，覆輪形成に及ぼす温度条件について再度検討するとともに，ケミカル処理を行い，覆輪形成幅の制御を試みる．

Causes of Carryover

交付申請書作成後に，研究分担者との研究内容の打ち合わせを行った結果，2年目以降の必要経費が当初見込みよりも大きくなることが予想されたことから，初年度の実験内容を一部見直し，経費の節減に努め，研究計画の効率的な遂行に努めた．