2017 Fiscal Year Research-status Report
３型分泌系遺伝子発現を遮断するアンタゴニスト創成に向けた植物シグナルの探索
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17K07667
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
大西 浩平 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (50211800)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木場 章範 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (50343314)
曵地 康史 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (70291507)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 植物病原細菌 / hrp / 遺伝子発現解析 / レポーター遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
青枯病菌の初期感染を成立させる植物シグナルの同定を目的とし次の３つの成果を得た。
（１）既に作製済みの二成分制御系センサーカイネース遺伝子欠損株を、ナスの葉に接種し、hrpレギュロンの発現量をpopA-lacZレポーター遺伝子の発現として測定した。その結果、大部分の欠損株は野生株と同等の発現量を示したが、rsc1075変異株，rsp1676変異株，rsc0039変異株，rsc1598変異株におけるhrpレギュロンの発現は野生株に比べてわずかではあるが低下していた。４種類の遺伝子すべてを欠損させた変異株及びrsc0039とrsc1598の２遺伝子変異株は、hrpレギュロンの発現が植物体内においてのみ顕著に低下した。また、これらの変異株は病原力の低下も認められた。更にHrpGによって発現が直接制御されるhrpレギュロンの転写調節因子hrpBの発現も、植物体内においては野生株に比べて半分程度まで減少していた。以上のことから、rsc0039とrsc1598遺伝子産物が植物シグナルの受容体である可能性が強く示唆された。一方で、TBDR変異株も同様の実験に供したが、野生株に比べてhrpレギュロンの発現が低下する株は、既知のprhA変異以外は検出されなかった。
（２）野生株における二成分制御系レスポンスレギュレーターのリン酸化検出のために、対象とするタンパク質のC末端側にFLAG-tagを付加し、抗体を用いて検出する方法、ならびにphos-tagを利用したSDS-PAGEによってリン酸化タンパク質を検出する方法を確立した。
（３）植物からのシグナル因子精製のために、hrpBもしくはpopAのプロモーターをGFPの上流に挿入した検出用検定菌を作製し、蛍光マイクロタイタープレートを利用したhigh-throughputなスクリーニングを行える系を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度の研究計画の大項目３つのうち、１と２は完全に目標を達成した。また、３については植物由来シグナル因子の精製のための系は構築できたものの、精製までは取りかかることが出来なかったことから、やや遅れ気味である。以上のことから、全体としては、おおむね順調に進展しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
３つの大項目について、次のような研究を計画している。
（１）については、平成29年度で順調に終了したことから、行わない。
（２）平成29年度にhrpレギュロンの発現が顕著に減少することが確認されたマルチ欠損株のバックグランドにおいて、HrpG-FLAG-tagもしくはPrhG-FLAG-tag発現株を構築する。この株を用いて、HrpGとPrhGのどちらか、もしくは両方のリン酸化が起こらないことを確認する。また、実際にリン酸転移反応がおこるかどうかについて精製したセンサーカイネースとレスポンスレギュレーターを用いた反応を行う。HrpGもしくはPrhG に対応することが明らかとなったセンサーカイネースが本当にそれぞれをリン酸化するのか確かめるため、センサーカイネースのC末端部分（膜タンパク質であることからリン酸化部位が存在する細胞質部分のみ）を大腸菌で発現し精製する。同様にHrpGおよびPrhGのリン酸化部位を含むN末端部分を精製する。C末端HKを32Pで自己リン酸化し、N末端HrpGおよびPrhGにリン酸基が転移するか調べる。
（３）平成29年度に構築した蛍光GFPを利用したアッセイ系を利用して、植物体の葉および根からシグナル因子の精製を開始する。
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| Causes of Carryover |
試薬等の購入をキャンペーンを利用し、より安価に行うことができたため。
植物の成分の精製にとりかかれなかったことから、そのためのカラムの購入の費用がかからなかったため。
平成２９年度購入予定の試薬などを平成３０年度に購入することから、予定どおり使用することができる。
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