2017 Fiscal Year Research-status Report
Influence of the expression of cis,cis-muconate isomerase mutant on aromatic compounds metabolism
| Project/Area Number |
17K07706
|
|---|
| Research Institution | Hirosaki University |
|---|
Principal Investigator |
園木 和典 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (20502264)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | cis,cis-muconic acid / 安息香酸 / リグニン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では安息香酸の分解代謝に関わるcis,cis-muconate cycloisomerase (CatB) の酵素活性を条件依存的に制御し、安息香酸やリグニン由来の芳香族化合物などを炭素源として増殖し、かつcis,cis-muconic acidを生産できる新たな微生物反応の創出に取り組む。ΔcatB変異によりcis,cis-muconic acidを蓄積する微生物株は，安息香酸を炭素源として増殖することができないが，野生型のcatB (catB-wt) を発現することで増殖能は回復した。Error-prone PCR法を利用して作成したcatB変異体ライブラリーを用いてΔcatB株を形質転換し，培養温度に依存して増殖能が回復する形質転換体を探索した結果，25oCの培養条件では増殖を示すものの、32oCでは増殖しない表現型を与えるcatB変異体 (catB-mut) を得た。休止菌体反応を用いてcatB-mut発現株のBA代謝能を評価した結果，反応温度の上昇に伴いcis,cis-muconic acidの蓄積量が増加し、培養温度に依存してcis,cis-muconic acid分解能が変化したことが示された。catB-mut遺伝子の塩基配列を解析した結果、2か所の点変異 (E6V、I220T) が起こっていたもののレアコドンへの変化ではなかった。CatB-mutの精製に先立って、休止菌体反応を利用しCatB-mutタンパク質のCatB活性を評価した。catB-wt遺伝子を発現する組換え大腸菌はccMAを分解したが、catB-mut遺伝子を発現する組換え大腸菌はいずれの反応温度でもccMAを分解できなかった。しかしΔcatB変異によりcis,cis-muconic acidを蓄積し、安息香酸を炭素源として増殖できない微生物株は、catB-mut遺伝子の発現により培養温度に依存した増殖を示した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ΔcatB株の安息香酸の資化性に温度感受性を与えるcatB変異体 (catB-mut) を同定し、その一次構造を明らかにした。生化学的評価・構造解析に向けてCatB-mutの精製を検討したものの、当初の想定とは異なりCatB-mutはCatB活性を示さなかった。この対応として、catB-wtとcatB-mutをそれぞれ発現させたΔcatB株組換え体由来のmRNAについて、RNA-Seq解析を進めているため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
当初計画通りに進まなかった時の対応として記載していた通り、catB-wtとcatB-mutをそれぞれ発現させたΔcatB株組換え体由来のtotal RNAからmRNA調製し、RNA-Seq解析を行い，catB-mut発現株に特異的な遺伝子発現の変化を解析する。ΔcatB株の親株であるP. putida KT2440株は，全ゲノムDNA情報が解読されているので，発現上昇・低下を示した遺伝子群の中から，転写制御因子，芳香族化合物代謝関連遺伝子などCatB-mut発現による表現型を誘導する候補遺伝子を抽出する。
また、多様なリグニン由来の芳香族化合物をcis,cis-muconic acidへと収束して蓄積させるためにΔcatB変異を有しているcis,cis-muconic acid生産株にCatB-mutを発現させ，安息香酸やリグニン由来の芳香族化合物の代謝に対する効果を評価する。
|
Research Products
(3 results)
