Identification of vesicular-transport-related factors required for autophagosome formation and their roles

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K07707
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 新谷 尚弘 東北大学, 農学研究科, 教授 (70374973)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 出芽酵母 / オートファジー / 小胞輸送

Outline of Annual Research Achievements

オートファジーは栄養飢餓に応答して細胞質成分をオートファゴソーム（以下、APと省略）で包み込み、リソソーム・液胞へ送り、分解・再利用する機構である。APの形成に必要な膜成分は細胞内小胞輸送系（特に、小胞体）が供給源であることが示唆されている。前年度までに出芽酵母の細胞内小胞輸送経路で機能する小胞膜融合因子であるYkt6の各種変異株を用いて、Ykt6がAPの形成およびAPと液胞との融合に関わることを明らかにしてきた。Ykt6はそのC末端が脂質修飾されることによってオルガネラ膜に局在するため、Ykt6がAPあるいはその前駆体膜にターゲットされる機構はオートファジーの制御に重要であると考えられた。そこで、APにターゲットされない新たなYkt6変異体の作製を試みた。AP膜にはホスファチジルイノシトール３リン酸が多く含まれ、負に帯電していることが知られている。そのため、Ykt6タンパク質の正電荷とAP膜の負電荷が相互作用していると仮定し、Ykt6表面の負電荷のパッチを形成する領域に変異を導入した変異体を複数作製し、オートファジーへの影響を解析した。1つの変異体は酵母が致死となり、解析が不能であった。残りの変異体はいずれももオートファジー活性に影響を与えなかった。このことから、Ykt6とAPの静電的相互作用はYkt6の局在化に貢献していないことが示唆された。
選択的オートファジーの一種であるcytoplasm-to-vacuole targeting経路において、その基質であるアミノペプチダーゼI（Ape1）にAP膜の前駆体がリクルートされることが分かっている。そこでApe1をベイトとしたアフィニティー精製を行ったところ、SDS-PAGEで数種類の候補タンパク質が検出されたが、質量分析の結果、いずれもApe1自身であることが明らかとなり、新規のタンパク質を同定することはできなかった。