2018 Fiscal Year Research-status Report
セミドライ反応系でのα-1,3-グルカナーゼ転移反応の検討とニゲロオリゴ糖生産
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17K07708
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
矢野 成和 山形大学, 大学院理工学研究科, 准教授 (50411228)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今野 博行 山形大学, 大学院理工学研究科, 教授 (50325247)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | α-1,3-グルカナーゼ / 転移反応 / ニゲロオリゴ糖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
B. circulans KA-304由来α-1,3-グルカナーゼAgl-KAの転移活性を調べるために、基質となるニゲロオリゴ糖の大量調製法を検討した。ニゲロオリゴ糖は、α-1,3-グルカンをAgl-KAで加水分解することで、ニゲロース、ニゲロトリオース、ニゲロテトラオースを得ることができる。しかし、不溶性基質であるα-1,3-グルカンを加水分解しても還元糖量として5 mM程度しか得られなかった。そこで、α-1,3-グルカンをNaOHにて可溶化した後にAgl‐KAで加水分解することで、10 mMまで増加した。また基質濃度を1％から4％まで高めることで、遊離還元糖量が約25 mMとなった。薄層クロマトグラフィーで生成物を確認した結果、2,3,4糖だけでなく、5糖が生成していた。
得られたニゲロオリゴ糖を用いて、α-1,3-グルカナーゼの転移活性を調べた。なお、酵素は、触媒ドメインのみからなる変異酵素Agl-KAΔDCD-UCDを用いた。前年度では、酵素と基質を混合後に凍結乾燥し吸湿させることで、水分子が極めて少ない条件で反応を行った。今年度は、水溶性の優れたエチレングリコール、グリセロールを45-90％になるように添加して反応を試みた。しかしながら、転移反応を確認することができなかった。次に、高濃度基質条件（10％2,3,4糖混合物）で転移反応を行った。各種pH条件で活性を調べた結果、pH 10 付近で転移反応が確認され、4糖以上の長鎖オリゴ糖が生成していた。
細菌型α-1,3-グルカナーゼの反応機構を明らかにするために、昨年度から引き続き結晶化条件の検討と得られた結晶のX線結晶解析を行った。触媒ドメインからなるAgl-KAΔDCD-UCDのメチオニンをセレノメチオニンに置換して結晶構造解析を行うことで、位相を決定することができ、立体構造を明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、低含水条件下におけるα-1,3-グルカナーゼAgl-KAの糖転移反応を明らかにすること、また、立体構造を解明することで反応機構を明らかにすること、が目的である。前年度まで、転移反応を解析するために著量の基質を必要とするため、多数の反応を行うことが困難であった。そこで、本年度は、オリゴ糖原料となるα-1,3-グルカンをアルカリ可溶化後に酵素加水分解することで、生成物量を約5倍に増やすことができた。本法を用いることで、2‐5糖のオリゴ糖を調製できるようになり、また、カラムクロマトグラフィーを行うことで、それぞれのオリゴ糖を分取することもできた。オリゴ糖の調製法を改善できたので、転移活性測定も多数の条件を検討することができた。
Agl-KAの転移活性測定に関しては、昨年度課題とした添加剤の影響（エチレングリコール、グリセロール等の水溶性に優れたもの）を調べることができた。結果として、転移活性を確認することはできなかったが、反応pHの影響等を再検証することができた。また、本年度は、Agl-KAの加水分解に必須なアミノ酸を変異させた変異酵素や、他の細菌由来のα-1,3-グルカナーゼについても検討を開始しており、当初の予定通りに研究が進んでいる。
結晶構造解析については、触媒ドメインからなるAgl-KAΔDCD-UCDのメチオニンをセレノメチオニンに置換した酵素を用いた結晶化に成功し、また、X線結晶構造解析を行うことができた。得られたデータから得た立体構造には、加水分解に必須なアミノ酸が触媒クリフト内に存在することを確認できた。
以上のように、転移反応解析につては順調に進行しており、結晶構造解析に関しては当初計画よりも進展している。今後、真菌型α-1,3-グルカナーゼに関しても研究を進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
低含水条件下におけるα-1,3-グルカナーゼAgl-KAの糖転移反応については、29年度ではAgl-KAと基質ニゲロオリゴ糖の混合物を凍結乾燥させて吸湿させることで転移反応が起きることを明らかにし、30年度ではpH 10付近の条件にすることで転移反応が進行することを示した。また、30年度では、転移反応を促進させる添加剤のスクリーニングや凍結乾燥の際の保護剤に関する検討を開始した。この実験項目に関しては、複数の条件を検討することが必要であるので継続して実験を進める。31年度では、ニゲロオリゴ糖以外のオリゴ糖に関しても保護材としての効果やアクセプターとしての役割を果たすかを調べ、転移反応を追跡しやすい添加剤も検討項目に加える。使用する酵素に関しては、30年度からAgl-KAの変異酵素や他の細菌に由来するα-1,3-グルカナーゼについても検討を行ったが、31年度では、真菌由来α-1,3-グルカナーゼも検討に加える。現在、大腸菌異種発現を構築しており、酵素が調製でき次第、実験を開始する。
Agl-KAの結晶構造解析は、29-30年度の研究の結果から立体構造を明らかにした。今後は、基質であるニゲロオリゴ糖を含んだ結晶の調製と、変異酵素の結晶の作製を行う必要がある。現在、加水分解に必須なアミノ酸3種のうち、1種類をアラニンに置換した変異酵素について結晶を作製している。30年度にニゲロオリゴ糖の調製方法を改善することができたので、ニゲロース、ニゲロトリオース、ニゲロテトラオースをそれぞれ分取できた。今後は、それぞれのオリゴ糖を添加した条件で結晶を作製する。あるいは、Agl-KAΔDCD-UCDの結晶をニゲロオリゴ糖でソーキングして構造解析を行う。
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| Causes of Carryover |
29年度は、ニゲロオリゴ糖の調製にかなりの時間を費やしたので、30年度は凍結乾燥機を購入して大容量を容易に調製できるようにしようと試みた。当初は、凍結乾燥機の真空ポンプやドライチャンバーを購入する予定であったが、研究室所有のものが使用できた。また、ニゲロオリゴ糖調製法を改善することで、収量が増えたことから試薬類の購入費用を抑えることができた。これら以外に、論文投稿が30年度内に行えなかったことなどから、次年度使用額が生じた。
次年度では、結晶構造解析を中心に反応機構解明に向けた研究を行うので、それに必要な消耗品や試薬を購入する。また、オリゴ糖の誘導体化に必要な試薬やオリゴ糖の大量調製に必要なカラムなどを準備することでより、効率よく研究が行えるので、早期に検討を始める。次年度は最終年度なので、学術論文の投稿や学会発表も積極的に行う。
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Research Products
(2 results)
