2017 Fiscal Year Research-status Report

酵母におけるリン脂質の細胞内輸送と生体膜ロバストネス維持機構の解明

Research Project

Project/Area Number	17K07710
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	福田良一東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (50323481)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	Saccharomyces cerevisiae / Yarrowia lipolytica / リン脂質 / 輸送 / 脂質輸送タンパク質 / Sec14ファミリータンパク質 / 膜コンタクトサイト
Outline of Annual Research Achievements	① Saccharomyces cerevisiaeにおけるリン脂質の輸送機構の解析：蛍光標識リン脂質を用いたin vitroでのリポソーム間脂質輸送解析から、Sec14ファミリータンパク質であるSfh1がホスファチジルセリン（PS）を輸送できることが示唆された。細胞抽出液のショ糖密度勾配遠心解析により、Sfh1が細胞質以外に、エンドソーム、ゴルジ体、あるいは液胞に局在することが示唆された。これまでの結果とあわせ、Sfh1が小胞体からエンドソーム、ゴルジ体、液胞へのPSの輸送に関わる可能性が考えられた。 ② Yarrowia lipolyticaにおけるリン脂質の輸送機構の解析：ノーザン解析によりS. cerevisiaeのSec14ファミリータンパク質遺伝子SFH2のオルソログであるSFH21の転写がn-アルカンにより誘導されることが示唆された。また、SFH21破壊株はn-アルカン培地で菌糸状の生育に欠損を示すこと、3つのSFH2オルソログ、SFH21、SFH22、SFH23を全て破壊した株では菌糸生長の欠損が悪化することが明らかになった。これらの結果から、Y. lipolyticaにおいてSfh2オルソログがn-アルカン培地での菌糸成長に関わることが示唆された。 ③ S. cerevisiaeにおける生体膜ロバストネスの解析：酢酸菌においてホスファチジルエタノールアミン（PE）をホスファチジルコリン（PC）に変換するPEメチル化酵素pmtに細胞膜への移行シグナルおよびEGFPを連結した融合タンパク質をS. cerevisiaeで発現させた。顕微鏡観察によりこの融合タンパク質が細胞膜に局在することが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason S. cerevisiaeにおいてSfh1が小胞体からエンドソーム、ゴルジ体、液胞へのPS輸送に関わることを示唆する結果が得られたこと、Y. lipolyticaにおいてSfh2オルソログの機能の一端を明らかにすることができたことから、おおむね順調に進展していると考えられる。
Strategy for Future Research Activity	① Saccharomyces cerevisiaeにおけるリン脂質の輸送機構の解析：リン脂質輸送における膜コンタクトサイトなどの役割を解析する。SEC14およびSFH1-SFH5の6種のSec14ファミリータンパク質遺伝子を全て破壊した遺伝的背景で各タンパク質を単独で発現する株を作製し、表現型を観察することにより、それらの機能を解析する。 ② Yarrowia lipolyticaにおけるリン脂質の輸送機構の解析：SFH21破壊株および、SFH21、SFH22、SFH23三重破壊株の細胞内のリン脂質分布を解析する。Sfh21タンパク質が結合しているリン脂質の分子種を解析する。さらにSfh21タンパク質のリン脂質輸送能を解析する。また膜コンタクトサイト関連タンパク質遺伝子の破壊株を作製し、その表現型を解析する。 ③ S. cerevisiaeにおける生体膜ロバストネスの解析：PC合成に関わるPEM1、PEM2の二重破壊株においてpmtを細胞膜に局在させ、小胞体の代わりに細胞膜でPCを合成させた場合に生育が可能か検討する。また、細胞膜のリン脂質組成を解析する。この株において様々なストレス下での生育の解析や各脂質の合成酵素の発現量と活性の解析を行うことにより、PC合成を細胞膜で行うことによる影響を調べる。
Causes of Carryover	当該年度は、当初の予定より物品比が少なかったため、99,758円を次年度に使用する。次年度は、試薬類、酵素類、使い捨てプラスチック器具、標識化合物、ガラス器具、合成DNAの購入のための物品比として900,000円を、国内外の学会参加のための旅費として300,000円を、塩基配列解析にかかる費用および論文投稿にかかる費用として199,758円を使用する計画である。