Exploration and functional analysis of a formaldehyde-driven glycine hydroxymethyltransferase

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07720
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 本田 孝祐 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (90403162)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: グリシンヒドロキシメチル転移酵素 / ホルムアルデヒド / 5’,10’-メチレンTHF / セリン / 好熱菌

Outline of Annual Research Achievements

本課題では、近年報告されたホルムアルデヒド駆動型3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase（MOBHMT）の発見に着想を得て、ホルムアルデヒドをヒドロキシメチル基供与体として利用可能なglycine hydroxymethyltransferase（GHMT）の探索と同酵素を用いたグリシン、ホルムアルデヒドからのセリン生産に取り組む。平成29年度は約10種類の好熱菌由来GHMTを大腸菌内で発現させ、得られた組換え酵素を用いたアッセイを実施した。この結果、2種類の好熱性酵素（Thermoplasma acidphilumおよびThermus thermophilus由来酵素）において、ホルムアルデヒド依存的なグリシンからのセリン合成活性を見出すことに成功した。また興味深いことに、活性が認められた酵素のうち、好熱性細菌Thermus thermophilus由来のものは、本来のヒドロキシメチル基供与体である5’,10’-methylene-tetrahydrofolate（methylene-TFH）使用時には活性を示さず、ホルムアルデヒド存在下でのみグリシンのヒドロキシメチル化を触媒することを見出した。この現象は、同酵素が大腸菌内でTHFを分子内に取り込んだホロ酵素として生産されている可能性を示唆するものである。平成30年度以降は、この推察の当否を検証するとともに酵素反応条件の最適化を実施し、得られた酵素群による新規セリン合成法のフィージビリティーを評価する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

既知のGHMTのアミノ酸配列との相同性を指標に9種の好熱菌から11種のGHMT様遺伝子を選抜、これらを大腸菌内で発現させた。SDS-PAGEによる組換えタンパク質発現解析の結果、4種のタンパク質で良好な発現を確認することができた。これらをホルムアルデヒド存在下でグリシンとインキュベートし、期待される生産物であるセリンの生産の有無をHPLCにて検証した。この結果、Thermoplasma acidphilum、Thermus thermophilus由来酵素（それぞれGHMT_Ta、GHMT_Ttとする）を用いた際にセリンと保持時間を等しくするピークが検出された。これら2種類の酵素について、熱精製およびゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製を行い、得られた標品を用いてホルムアルデヒド、ならびにGHMTの本来のヒドロキシメチル基供与体であるmethylene-THFをドナーとしたグリシンのヒドロキシメチル化反応を実施した。GHMT_Taを用いた場合、ホルムアルデヒド、methylene-THFのいずれをドナーとした場合にも活性が認められた。一方、GHMT_Ttを触媒とした場合、ホルムアルデヒド存在下でのみ活性が認められ、methylene-THFをドナーとしたセリン生成を確認することはできなかった。この原因として、GHMT_Ttは大腸菌内においてTHFをポリペプチド鎖内に取り込んだホロ酵素として生産されている可能性が考えられる。この場合、得られるホロ酵素は、遊離のmethylene-THFとは反応しない一方で、ホルムアルデヒド存在下では酵素分子中のTHFとホルムアルデヒドとが分子内で自発的にmethylene-THFを形成し、これがセリン合成に用いられるとの推察を立てることができる。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度以降はまず、GHMT_Ttが示すユニークなヒドロキシメチル基供与体要求性の原因を究明することに力を注ぐ。本酵素が大腸菌内であらかじめTHFを取り込んだホロ酵素として生産されている可能性を鑑み、再構成型無細胞転写翻訳システムであるPure System（Shimizu et al. (2001) Nat. Biotecnol., 19, 751）を用いたアポ酵素の生産と、得られた酵素を用いた活性測定を実施する。ホルムアルデヒドおよびmethylene-THF存在下でのセリン生産能を評価することで上述の推察の妥当性を評価する。
また以上とは別に、GHMT_Ta、GHMT_Ttのそれぞれについて酵素化学的な一般的諸性質（温度、pH依存性、立体選択性など）を解明する。また平成29年度の取り組みにおいて異なるヒドロキシメチル基供与体要求性を示したそれぞれの好熱性酵素について、そのアミノ酸配列上の類似性を精査し、各酵素のドナー分子要求性の差異に重要な役割を果たす構造上の特性を推察する。またホルムアルデヒド依存型活性を示した酵素によるmethylene-THF非依存的なセリン合成反応の最適条件を決定し、同条件下での触媒能力を定量することで、新規セリン合成用触媒としてのこれらのパフォーマンスを評価する。

Causes of Carryover

平成29年度の主たる実施内容は目的活性を有した微生物由来酵素の探索研究であった。研究の結果、比較的少数の微生物サンプルを解析するのみで目的酵素を取得することに成功したため、当初予算に比べ、物品費に余剰が生じた。
次年度以降は、平成29年度に得られた酵素の詳細な解析を行う。様々な条件下で酵素アッセイを行うため、反応に必要な試薬が著量必要となる。特に、目的酵素反応の補因子であるテトラヒドロ葉酸は高額かつ必要量も多くなることから、次年度使用額はこれらの試薬購入費に充当する。