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2017 Fiscal Year Research-status Report

Structural-functional analysis of the radiation-inducible protein DdrA and its paralog DdrAP

Research Project

Project/Area Number 17K07730
Research InstitutionToyo University

Principal Investigator

鳴海 一成  東洋大学, 生命科学部, 教授 (90343920)

Project Period (FY) 2017-04-01 – 2020-03-31
KeywordsDNA修復タンパク質 / 放射線抵抗性細菌 / DNA損傷誘導性 / ゲノム2本鎖切断修復
Outline of Annual Research Achievements

放射線誘導性タンパク質DdrA及びそのパラログDdrAPの構造機能解析の一環として、D. radiodurans ddrA遺伝子及びddrAP遺伝子の欠失株を作製した。具体的には、ddrAプロモーター上流750 bp、カナマイシン耐性マーカー1,065 bp、D. radiodurans ddrA遺伝子下流領域750 bpを、4種類の異なる制限酵素切断部位タグ付きプライマーでそれぞれPCR増幅後、制限酵素処理とライゲーションでタンデムに連結したDNA断片を用いて、D. radiodurans野生株(ATCC13939)を形質転換し、ddrA欠失株を作製した。また、D. radiodurans ddrAP遺伝子についても同様にして、ハイグロマイシン耐性マーカーとすげ替えた形のddrAP欠失株を作製した。作製したddrA遺伝子欠失株はマイトマイシンCに対して中程度の感受性を示したのに対して、ddrAP遺伝子欠失株はマイトマイシンCに対して僅かな感受性を示した。パルスフィールドゲル電気泳動によるゲノム2本鎖切断修復過程の解析については、供試する細胞濃度、アガロースゲルプラグの調製、プロテイナーゼK処理及び制限酵素NotI処理の条件検討を行い、最適条件を決定した。タンパク質の精製については、D. radiodurans ddrA構造遺伝子領域をPCR増幅したものをpET9aベクターのNdeI-BamHI部位にクローニングし、大腸菌BL21(DE3)をpLysSプラスミドと共に形質転換することで、発現系を構築した。IPTG誘導でnative formのDdrAタンパク質が可溶性画分に大量に生産されていることを確認した。さらに、真核生物のDNA修復タンパク質Rad52との相同性が見られるDdrAタンパク質のアミノ酸末端から157番目の残基までからなる欠失変異型タンパク質DdrA157についても同様に、大腸菌BL21(DE3) pLysSの発現系で可溶性画分に大量に生産させることに成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ddrAとddrAPの二重遺伝子欠失株がまだ作製できていない。二重遺伝子欠失が細胞にとって致死的であることも考えられるが、平成29年度の実験で明らかになったマイトマイシンCに対する感受性の程度を勘案すると、二重遺伝子欠失株の取得は可能であると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

D. radioduransは多倍体ゲノムを持つので、二重遺伝子の完全欠失が細胞にとって致死的である場合でも、複数コピーの遺伝子の一部のみが欠失した形のHemi欠失株であれば取得できる可能性が高いため、選択マーカーの濃度等を勘案しながら、ddrAとddrAPの二重遺伝子欠失株の取得を急ぐ。

Causes of Carryover

ddrAとddrAPの二重遺伝子欠失株がまだ取得できていないため、変異原感受性試験に要する消耗品費を次年度に使用する必要が生じた。当該二重遺伝子欠失株を平成30年度に取得した後に、変異原感受性試験に要する消耗品費を使用する計画である。

  • Research Products

    (21 results)

All 2018 2017 Other

All Int'l Joint Research (1 results) Journal Article (3 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (16 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Invited: 2 results) Remarks (1 results)

  • [Int'l Joint Research] 韓国原子力研究所(韓国)

    • Country Name
      KOREA (REP. OF KOREA)
    • Counterpart Institution
      韓国原子力研究所
  • [Journal Article] Draft genome sequence of the radioresistant bacterium Deinococcus aerius TR0215, isolated from the high atmosphere above Japan2018

    • Author(s)
      Katsuya Satoh、 Hiroki Arai、Toshihiko Sanzen、Yuko Kawaguchi、Hidenori Hayashi、Shin-icni Yokobori、Akihiko Yamagishi、Yutaka Oono、Issay Narumi
    • Journal Title

      Genome Announcements

      Volume: 6 Pages: e00080-18

    • DOI

      https://doi.org/10.1128/genomeA.00080-18

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Effect of dnaE2 knockout and overexpression in the radioresistant bacterium Deinococcus grandis2018

    • Author(s)
      Kota Omoso、Katsuya Satoh、Yutaka Oono、Issay Narumi
    • Journal Title

      QST Takasaki Annual Report 2016

      Volume: 2 Pages: 94

  • [Journal Article] PprM, a Cold Shock Domain-Containing Protein from Deinococcus radiodurans, Confers Oxidative Stress Tolerance to Escherichia coli2017

    • Author(s)
      Park Sun-Ha、Singh Harinder、Appukuttan Deepti、Jeong Sunwook、Choi Yong Jun、Jung Jong-Hyun、Narumi Issay、Lim Sangyong
    • Journal Title

      Frontiers in Microbiology

      Volume: 7 Pages: article 2124

    • DOI

      https://doi.org/10.3389/fmicb.2016.02124

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 宇宙でDeinococcus radiodurans R1に生じたDNA損傷の解析2018

    • Author(s)
      矢田部純、河口優子、木下伊織、藤原大祐、青木元秀、谷口紀恵、鳴海一成、澁谷美緒、橋本博文、横堀伸一、山岸明彦
    • Organizer
      生命の起源および進化学会第43回学術講演会
  • [Presentation] 宇宙環境下で曝露したDeinococcus radiodurans R1のrpoB遺伝子の突然変異2018

    • Author(s)
      藤原大佑、河口優子、冨樫油香、木下伊織、矢田部純、鳴海一成、橋本博文、横堀伸一、山岸明彦
    • Organizer
      生命の起源および進化学会第43回学術講演会
  • [Presentation] 微生物の宇宙生存とDNA損傷2018

    • Author(s)
      河口優子、澁谷美緒、林梨沙子、藤原大佑、矢田部純、谷口紀恵、青木元秀、鳴海一成、橋本博文、横堀伸一、山岸明彦
    • Organizer
      第18回宇宙科学シンポジウム
  • [Presentation] 放射線抵抗性細菌Deinococcus grandisのDnaE2欠損株と定常発現株の解析2017

    • Author(s)
      三善英彦、面曽宏太、鳴海一成、佐藤勝也、大野豊
    • Organizer
      QST高崎サイエンスフェスタ2017
  • [Presentation] 放射線抵抗性細菌のDNA修復機構に関する研究2017

    • Author(s)
      鳴海一成
    • Organizer
      2017年日本細菌学会関東支部インターラボセミナー
  • [Presentation] Deinococcusのスフェロプラストに関する研究2017

    • Author(s)
      梅村幸佑、森田裕介、西野弘起、白谷周作、鳴海一成、大島拓、西田洋巳
    • Organizer
      第10回北陸合同バイオシンポジウム
  • [Presentation] Mechanisms underlying survival capacity of radioresistant microbes in extreme environments2017

    • Author(s)
      Issay Narumi
    • Organizer
      科学研究費補助金 新学術領域研究「冥王代生命学の創成」平成29年度第2回白馬ワークショップ
    • Invited
  • [Presentation] 宇宙でDeinococcus radiodurans R1に生じたDNA損傷2017

    • Author(s)
      矢田部純、河口優子、木下伊織、藤原大佑、青木元秀、谷口紀恵、鳴海一成、澁谷美緒、橋本博文、横堀伸一、山岸明彦
    • Organizer
      日本宇宙生物科学会第31回大会
  • [Presentation] 宇宙環境下で生じるDeinococcus radiodurans R1のrpoB遺伝子の突然変異2017

    • Author(s)
      藤原大佑、河口優子、冨樫油香、木下伊織、矢田部純、鳴海一成、中川和道、橋本博文、横堀伸一、 山岸明彦
    • Organizer
      日本宇宙生物科学会第31回大会
  • [Presentation] 500μm厚のDeinococcus属の細胞凝集体は1年間宇宙で生存できる2017

    • Author(s)
      河口優子、木下伊織、矢田部純、谷口紀恵、鳴海一成、林梨沙子、藤原大佑、村野由佳、青木元秀、橋本博文、横堀伸一、山岸明彦
    • Organizer
      日本宇宙生物科学会第31回大会
  • [Presentation] 放射線に耐える奇妙な球菌が極限環境で生きる仕組み2017

    • Author(s)
      鳴海一成
    • Organizer
      第24回自然科学研究機構シンポジウム「極限環境における生命 ~生命創成の探究に向けて~」
    • Invited
  • [Presentation] 500 μm cell-aggregate of Deinococcus spp. was sufficient to survive after one-year exposure on ISS orbit in Tanpopo mission2017

    • Author(s)
      Yuko Kawaguchi、Iori Kinoshita、Jun Yatabe、Yuka Murano、Daisuke Fujiwara、Risako Hayashi、Miu Harada、Kazumichi Nakagawa、Issay Narumi、Satoshi Kodaira、Yukio Uchihori、Hirofumi Hashimoto、Shin-ichi Yokobori、Akihiko Yamagishi
    • Organizer
      European Astrobiology Network Association Workshop (EANA17)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 500 μm cell-aggregation of Deinococcus spp. was enough thickness to survive after 384 days exposure at ISS orbit in Tanpopo mission2017

    • Author(s)
      Yuko Kawaguchi、Iori Kinoshita、June Yatabe、Yuka Murano、Daisuke Fujiwara、Miu Harada、Kazumichi Nakagawa、Issay Narumi、Satoshi Kodaira、Yukio Uchihori、Hirofumi Hashimoto、Shin-ichi Yokobori、Akihiko Yamagishi
    • Organizer
      日本地球惑星科学連合2017年大会
  • [Presentation] Survivability and DNA damage of Deinococcus spp. in cell-aggregates exposed to space in Tanpopo mission2017

    • Author(s)
      Iori Kinoshita、Yuko Kawaguchi、June Yatabe、Yuka Murano、Daisuke Fujiwara、Miu Harada、Kazumichi Nakagawa、 Issay Narumi、Satoshi Kodaira、Yukio Uchihori、Hirofumi Hashimoto、Shin-ichi Yokobori、Akihiko Yamagishi
    • Organizer
      日本地球惑星科学連合2017年大会
  • [Presentation] Mutation analysis of the rpoB gene in the radiation-resistant bacterium Deinococcus radiodurans R1 exposed to space2017

    • Author(s)
      Daisuke Fujiwara、Yuko Kawaguchi、Yuka Togashi、Iori Kinoshita、Jun Yatabe、Issay Narumi、Kazumichi Nakagawa、Hirofumi Hashimoto、Shin-ichi Yokobori、Akihiko Yamagishi
    • Organizer
      日本地球惑星科学連合2017年大会
  • [Presentation] Analysis of DNA damage in the radiation resistant microbe Deinococcus radiodurans R1 exposed to space in Tanpopo mission2017

    • Author(s)
      Jun Yatabe、Yuko Kawaguchi、Iori Kinoshita、Daisuke Fujiwara、Motohide Aoki、Kie Taniguchi、Issay Narumi、Shigenori Iwai、Hirofumi Hashimoto、Shin-ichi Yokobori、Akihiko Yamagishi
    • Organizer
      日本地球惑星科学連合2017年大会
  • [Remarks] 東洋大学 生命科学部 生命科学科 放射線微生物学研究室

    • URL

      http://www2.toyo.ac.jp/~narumi/index.html

URL: 

Published: 2018-12-17  

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