2017 Fiscal Year Research-status Report
ユビキノン生合成系に着目した高度有機溶媒耐性大腸菌の創製
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17K07731
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| Research Institution | Toyo University |
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Principal Investigator |
道久 則之 東洋大学, 生命科学部, 教授 (60302957)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 大腸菌 / キノン / 有機溶媒耐性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
バイオ燃料や化学製品等の有用物質生産の効率化のため、微生物の有機溶媒耐性機構が注目されている。我々は、大腸菌の単一遺伝子欠失株コレクション(Keio collection, 国立遺伝学研究所)の有機溶媒耐性度を調べ、多数の有機溶媒耐性に関与する遺伝子を新規に見出している。本研究では、電子伝達系の成分として知られるユビキノンの生合成系が大腸菌の有機溶媒耐性化に寄与するものと考え、高度な有機溶媒耐性度を示す菌株を構築することを目的とした。メナキノン生合成に関わるmenA欠失株は有機溶媒耐性度が顕著に向上した。親株（BW25113株）とmenA遺伝子欠失株は有機溶媒を添加しない場合には、生育頻度に差はなかった。メナキノンは、嫌気的呼吸鎖においてユビキノンに相当する電子伝達体として機能しており、menA遺伝子を欠失させると、ユビキノンが増加することが報告されている。また、ユビキノンの生合成（キノノイド構造部分の修飾・合成）に関与するubiG、ubiE、ubiHなどの遺伝子の欠失株では、著しく有機溶媒耐性が低下した。これらの結果より、メナキノンやユビキノン生合成が有機溶媒耐性に関与することが考えられた。ubiAおよびdxs遺伝子（いずれも、ユビキノン生合成に関与）発現用のプラスミドを導入したmenA欠失株を作製し、有機溶媒耐性を調べたところ、有機溶媒耐性には顕著な影響は認められなかった。一方、メナキノン生合成遺伝子の欠失によって蓄積することが予想される中間代謝物を培地に添加すると有機溶媒耐性が向上することを見出した。現在、この中間代謝物による有機溶媒耐性化機構についてさらに調べている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、予定していたubiAおよびdxs遺伝子（いずれも、ユビキノン生合成に関与）発現用のプラスミドを導入したmenA欠失株を作製し有機溶媒耐性を調べた。メナキノン生合成遺伝子の欠失によって蓄積する中間代謝物が有機溶媒耐性に関わることが新たに示唆されたため、現在、この中間代謝物添加の影響をさらに詳しく調べている。また、当初予定していた、AcrAB-TolCポンプ（既知の有機溶媒耐性機構）の発現量についても調べた。有機溶媒の排出活性測定法についても計画しており、予備的な検討を行った。以上から、おおむね計画に即して順調に進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
メナキノン生合成遺伝子の欠失によって蓄積する中間代謝物を培地に添加すると有機溶媒耐性が向上することを見出した。今後、この中間代謝物による有機溶媒耐性化機構についてさらに調べていく予定である。有機溶媒耐性については、上記のような固形培地に有機溶媒を重層して生育頻度を調べる方法（疎水性有機溶媒の場合のみ）や液体培地に有機溶媒を添加して増殖経過を測定する方法により調べる。添加する有機溶媒としては、細菌に対して比較的毒性の強い疎水性有機溶媒 (ヘキサン、シクロヘキサン、キシレンなど) のほかに、バイオ燃料として期待されている親水性有機溶媒のエタノールやブタノールなどについても検討する予定である。既知の有機溶媒耐性機構との関連を調べるため、AcrAB-TolCポンプの発現量や排出活性に影響するか否かについてさらに調べる。また、AcrAB-TolCポンプの発現制御因子への影響についても調べることにより、メナキノン生合成遺伝子の欠失による有機溶媒耐性化についてさらに明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
予定していた試薬の納期が大幅に延びてしまったため、次年度、使用することにした。
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