Structure and function of pilus tip proteins of Lactococcus lactis

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07741
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 鈴木 チセ 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, 研究領域長 (80343820)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: mannobiose / cell surface protein / lectin domain / Lactococcus lactis / mannnoprotein

Outline of Annual Research Achievements

１）　Lactococcus lactis G50の細胞表層タンパク質YwfGはN末端側からL型レクチンドメイン(LD)、ユビキチン様β-grasp foldドメイン(GD)、続いてムチン結合ドメイン(MD)が4つ連なる構造をもつ。LD (28-270)、LD-GD (28-336)、LD-GD-MD1 (28-511)およびMD4 (860-1034)の４つの領域を大腸菌で発現させた後、精製を行い、alpha1,2-、alpha1,3-、alpha1,4-、alpha1,6-マンノビオースとの相互作用解析を等温滴定型カロリメトリー（ITC）を用いて実施した。LDに対して４種のマンノビオースはいずれも結合を確認したがalpha1,2-マンノビオースに対する結合能がもっとも高かった（解離定数KD=34microM）。興味深いことに、マンノビオースとの結合はLDのみで測定され、LD-GD、LD-GD-MD1は全く結合性を示さなかった。
2)マンナンタンパク質放出性をもつSaccharomyces cerevisiae AB9（MATa/alpha gpi10/gpi10）およびmnn2変異株AB9-2(isogenic to AB9) の培養ろ液を限外濾過後エタノール沈澱したものをマンナンタンパク質として用い、ITC解析を行なった。AB9株由来のマンナンタンパク質とLDとのITC解析において結合エネルギーが観測できた。一方、alpha1,2-マンノース転移酵素欠損株であるAB9-2株由来のマンナンタンパク質（alpha1,2-結合のマンノースが少ない）ではAB9株由来と比べてLDとの結合性が低い傾向が見られ、マンノビオースの結果と矛盾しない結果が得られた。
3) LD-GD-MD1結晶にalpha1,2-マンノビオースをソーキングした結果、結合が確認された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナの影響もあり、思うように実験が出来なかったが、マンノビオースとの相互作用が詳細に解析できた。また当初は予定していなかったマンナンタンパク質が容易に得られる酵母株の提供も受けることができ、解析の幅が広がったと考えている。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度より農研機構から日本大学に異動したため、これまでのデータを取りまとめて論文化する。
LDのみでマンノースやマンノビオースとの相互作用が認められ、それ以降のドメインがあると相互作用がなくなる現象については、詳細な解析が必要である。YwfGについては、さらに日本大学の菌株を用いて、その局在や酵母との相互作用について解析を進める。

Causes of Carryover

新型コロナの影響で学会発表や国際学会参加が不可能になった。培養細胞を用いた実験 を計画していたが、相互作用を酵母の凝集反応を用いて実施する方法に変更したため、ELISA等の高額なキットの購入がなかった。YhgDに対する抗体作成がタンパク質の不安定性から困難であった。日本大学に異動したため、これまでの実験を継続するための試薬、電気泳動装置などを購入する必要がある。