2017 Fiscal Year Research-status Report
Recognition mechanism of carrier protein by acyltransferase
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17K07747
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
宮永 顕正 東京工業大学, 理学院, 助教 (10623126)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 微生物酵素 / 結晶構造解析 / タンパク質間相互作用 / クロスリンク / ポリケタイド合成酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ポリケタイド化合物の生合成において、アシル基転移酵素 (AT) はポリケタイドの構成単位となるアシル基質を認識し、アシル基を対応するアシルキャリアータンパク質 (ACP) へと受け渡す反応を触媒する。この際に、ATは対応するACPをタンパク質間相互作用によって認識していると考えられている。しかし、ATとACPの相互作用は弱く、一時的にしか複合体を形成しないため、複合体の構造解析が困難であり、ACPの認識機構の詳細については不明な点が多い。本研究では、ポリケタイド生合成に関わる様々なATを対象に、クロスリンク法を利用したACPとの複合体の結晶構造解析を行うことにより、詳細かつ包括的なACP認識機構の解明を目指す。
本年度は、Sorangium cellulosum由来のジソラゾール合成酵素 (DSZS) におけるATとACPの複合体構造解析を試みた。まず、1,2-ビスマレイミドエタンを用いてクロスリンク反応を検討したが、非特異的なクロスリンク反応が進行し、目的の複合体を得ることはできなかった。そこで、特異的なクロスリンク反応を実現するために、反応性官能基を有するプローブを設計、合成した。合成プローブを用いてDSZS-ACPを修飾した後に、DSZS-ATと混合したところ、DSZS-ATとDSZS-ACPの複合体が特異的に得られることが分かった。次に、得られた複合体を精製し、結晶化を検討したところ、DSZS-ATとDSZS-ACPの複合体の結晶が得られ、そのX線結晶構造を決定することに成功した。これはtrans-AT型ポリケタイド合成酵素におけるAT-ACP複合体の初めての結晶構造である。以前に決定したVinK-VinL複合体構造と比較したところ、ACPの結合様式が異なっていたことから、ATとACPの種類によってACPの認識機構が異なる可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
クロスリンク法を用いたATとACPの複合体の結晶構造解析を検討したところ、ジソラゾール生合成に関わるDSZS-ATとDSZS-ACP複合体の結晶構造決定に成功し、それらの間に存在するタンパク質間相互作用を明らかにすることができたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
決定したDSZS-ATとDSZS-ACP複合体構造の妥当性を評価するため、ACPの変異体を作製し、タンパク質間相互作用の強さが変化するかを調べる。他のポリケタイド化合物の生合成に関わるATとACP間のタンパク質間相互作用についても結晶構造解析や変異体解析などの方法により調査する。
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| Causes of Carryover |
本研究を開始した当初は、1,2-ビスマレイミドエタンを用いたクロスリンク反応を軸とした研究を計画していた。しかし、研究を進めたところ、1,2-ビスマレイミドエタンを用いた方法では非特異的なクロスリンク反応が起こることが分かり、パンテテインアミドプローブを用いたクロスリンク反応を軸とした研究へと方針転換した。これに伴って、必要経費についても変更が生じ、その結果として、次年度への研究費繰り越しが生じた。
次年度は、結晶構造解析、変異体酵素の作製と解析などに取り組む予定であり、研究費の大半は試薬やキット類など消耗品購入のための物品費に充てる。また、学会への参加と成果報告を予定しており、研究費の一部を旅費に充てる予定である。
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Research Products
(5 results)
