2017 Fiscal Year Research-status Report
Characterization and application of a novel dye-linked L-lactate dehydrogenase from thimophilic archaea
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17K07748
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
里村 武範 福井大学, 学術研究院工学系部門, 准教授 (50412317)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 酸化還元酵素 / 超好熱菌 / 呼吸鎖電子伝達系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、申請者が好熱好酸性アーキアより見出した色素依存性L-乳酸脱水素酵素 (Dye-LDH) の大腸菌、アーキアのそれぞれを宿主とする組換えタンパク質発現系を構築し組換えタンパク質の大量発現系の確立を行った。大腸菌による組換えタンパク質の発現は、発現タンパク質が大腸菌内で封入体を形成してしまったため活性を有したDye-LDHを回収することができなかった。一方、アーキアを宿主とするタンパク質発現では、宿主であるアーキア細胞内でDye-LDH活性を有した状態で発現させることに成功した。そこで、さらに大量の組換えタンパク質を宿主内で得るために、3種類の転写活性の強さの異なるプロモーター制御化でDye-LDH遺伝子の発現をアーキア宿主細胞内で行い組換えタンパク質発現の最適化を行った。その結果、この3種類のプロモーターのうち、Dye-DLDHの発現に最適なプロモーターを見出すことに成功した。この構築したアーキアを宿主とするDye-LDH発現系を用いて組換えタンパク質の発現を行い、精製法の検討を行った。その結果、本酵素を2段階の簡便な精製方法で単一に精製することに成功した。この精製酵素を用いて酵素の詳細な性質の解析を行ったところ、本酵素は二つの異なるサブユニットからなるヘテロ多量体構造を有していることが解った。本酵素をコードする遺伝子は3つの機能未知遺伝子とクラスターを形成しているが、精製タンパク質から得られた二つのサブユニットは、Dye-DLDHタンパク質と本酵素遺伝子とクラスターを形成している遺伝子産物であった。さらに、精製酵素の詳細な酵素化学的性質を解析したところ、本酵素は高い耐熱性を有しており今後検討する酵素機能電極用素子として有用であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請した実験計画通り、本年度はDye-LDHの組換えタンパク質の発現系の改良と精製方法の確立を行うことに成功した。また、酵素の詳細な性質の解析にも着手しており、おおむね本申請で計画したとおりに進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までに精製法が確立できたDye-LDHを用いて本酵素のタンパク質の結晶化条件の検討と酵素機能電極用素子の開発を進めていく。
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