2017 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
17K07752
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
高原 照直 名古屋大学, 生命農学研究科, 助教 (90708059)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | アミノ酸 / カルシウム / mTORC1 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、以下の２つの項目について研究を実施した。
(1)アミノ酸によるカルシウム流入に関わる因子の探索
これまでに各種カルシウムチャネル阻害剤を用いて見出した中に、TRPチャネル阻害のを有するamilorideによりmTORC1活性が抑制されることを見出していた。そこで、amilorideの標的TRPチャネルについてCRISPR-Cas9を用いたゲノム編集により、複数TRPチャネルについてノックアウト細胞を構築し、mTORC1活性化への影響を観察したが、いずれのノックアウト細胞もmTORC1の活性低下はみられなかった。このことから当該カルシウムチャネルは複数存在する可能性も考えられるため、候補因子について複数のノックアウト細胞の構築を進めている。
(2)細胞内カルシウム上昇とmTORC1活性を結びつける因子の探索
細胞内カルシウム上昇とmTORC1活性化を結びつける因子としてmTORC1活性化因子Rhebとの関連を見出していた。そこでRhebの相互作用因子の解析を行い、カルシウム結合因子を見出した。この因子がRhebを介したmTORC1活性化に寄与する可能性についてS6キナーゼのリン酸化を指標に評価したところ、過剰発現によってmTORC1活性化がわずかに抑制される可能性が考えられた。また、低分子量Gタンパク質であるRhebのGTP結合量がカルシウムにより影響を受ける可能性を調べるため、まずプルダウン法によるRheb活性の評価系の開発を進めた。GTPとGDP結合型Rhebとの結合が変わるプルダウン法系を得ており、今後さらなる最適化を進めていく。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、amilorideの標的候補であるカルシウムチャネルのノックアウト細胞を構築し、mTORC1活性化への影響をみることで、責任カルシウムチャネルの同定を進め、当初の計画に沿った形で結果が得られた。当初標的のアミノ酸依存的なカルシウム流入を司る候補カルシウムチャネルと推定していた分子をノックアウトしても特にmTORC1経路への影響は観察されなかったことは残念であるが、複数の重複した機能を有するカルシウムチャネルの関与や、amilorideの標的が全く新しい分子である可能性を示すといった結果をもたらしている。
また、カルシウム濃度上昇とmTORC1活性化をつなげる分子の候補の過剰発現でわずかではあるが、mTORC1活性への影響が観察されたことは、この分子が何らかの役割を担う可能性が得られた。さらに、Rheb活性評価系についてもプルダウン法により評価できるアッセイ系を立ち上げようと試みている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度の行った実験結果から得られた知見の1つとして、アミノ酸によるカルシウム流入を担う責任カルシウムチャネルが機能重複した複数からなる可能性が考えられるため、これについて検討する。また、これまでamilorideの作用が細胞表面のカルシウムチャネルを標的としているか、あるいは他の未知因子を標的にしているのかカルシウム量のモニター系を使い、これら２つの可能性について検証を進める。さらに当初の予定通り、オートファジーの誘導が促進されるかについてLC3の解析を行う。さらに最近、mTORC1の下流イベントとしてリソソーム生合成が同定されていることから、これまでに見出してきたアミノ酸による細胞内カルシウム上昇がもたらす意義としてリソソーム生合成を司る転写因子TFEBへの影響があるかについても検討する。
また、カルシウム濃度上昇後の細胞内標的因子についても本年度で得られた知見から候補の選抜を進める。また、これまで既知のmTORC1制御因子に着目してカルシウム依存的な結合の可能性についてカルシウムキレート剤などを利用して解析を進める。また、Rhebの新規活性測定系の開発を進めることで、カルシウム濃度上昇におけるRhebの活性変化を調べる。
|
