2018 Fiscal Year Research-status Report
Ｔ１ＳＳを利用した大腸菌による低分子抗体分泌生産システムの構築
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17K07759
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
湯浅 恵造 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 准教授 (70363132)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 低分子抗体 / タンパク質分泌生産 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Serratia marcescensは、2つのI型タンパク質分泌機構(Lipシステム、Hasシステム)を有し、選択的なタンパク質分泌を行っている。昨年度までにLipシステムを導入した大腸菌が一本鎖抗体scFv(VL-linker-VH)を分泌し、この分泌にscFvのC末端重鎖定常領域中のVal-Thr-Val(VTV)配列が関わることを見出したが、最終的に得られた精製scFvは極めて微量であった。scFv中のVLとVHの相互作用により、scFvの安定性や溶解度が低下し、凝集を引き起こすことが示唆されており、このことが低収量の原因の一つとして考えられた。そこで、安定性が高く、scFvと同様にC末端にVTV配列が含まれ、今後、更なる臨床応用が期待されているラクダ科動物由来Nanobodyについて、Lipシステムによる分泌生産を試みた。NanobodyはLip systemによって分泌され、イムノブロット解析において、scFvよりも多く分泌することが判明した。そこで、Strepタグを利用したアフィニティー精製を行った結果、培養液1Lあたりmgオーダーの精製Nanobody(CBB染色において単一のバンド)を取得することに成功した。さらに、分泌生産を高めるために、培養条件等の検討を行った。これまで発現タンパク質の凝集を防ぐために比較的温和な30℃、30時間で培養を行ってきたが、Nanobodyは熱に対して高い安定性を示すことから、培養温度を37℃に変更して行った。その結果、37℃、16時間の培養条件で、Nanobodyが従来の約50倍分泌されることが明らかとなった。加えて、アフィニティー精製のために、N末端にStrepタグを2つ付加していたが、その数を検討したところ、何も付加しないnon-Strep Nanobodyが最も多く分泌することが判明した(従来の2－3倍)。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分泌されたNanobodyが抗原結合能を有することを細胞免疫染色により確認しており、既に培養液1 Lあたりmgオーダーの抗原結合能を有する低分子抗体(Nanobody)の分泌生産が成功している。さらに、Nanobodyの分泌生産量を高める条件を見出しており、これらを組み合わせることにより、理論上100倍程度の分泌生産量の増大が期待できる。
また、Nanobodyの分泌機構の分子メカニズムとして、点変異実験により、C末端近傍のVTV配列が分泌に関わることを明らかにした。加えて、Lip system (LipB-LipC-LipD)の3つのコンポーネントのうち、membrane fusion protein (MFP)であるLipC単独によってNanobodyは分泌されるのに対して、Hasシステム(HasD-HasE-HasF)のMFPであるHasEによっては分泌されないことを明らかにした。これより、NanobodyはLipB-LipC-LipDの3コンポーネント全てが必要ではなく、LipCのみの極めてシンプルなシステムによって選択的に分泌されることが判明した。これまで複数の発現プラスミドを導入しなければならず、分泌システム構築の選択の幅が制限されていたが、たった2つの発現プラスミドの導入、場合によっては1つの導入によって分泌生産ができることが考えられた。
さらに、Lipシステム及びHasシステムによる選択的なタンパク質分泌機構の分子メカニズムも解明されつつあり、これらを利用して、より高効率な分泌システムの構築を行っていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまではアフィニティー精製とタンパク質の検出のために、N末端にStrepタグをタンデムに2つ、C末端にFLAGタグを1つ、それぞれ付加したNbを構築し、その分泌を調べていた。本年度の結果より、N末端にStrepタグを付加しないnon-Strep Nbが最も多く分泌することが明らかとなったため、現在、C末端にFLAGタグの代わりにStrepタグを付加したNbを構築し、これが分泌するか否か検討中である。分泌が確認出来次第、培養条件の検討で得られた最適条件と組み合わせて、分泌生産、さらにアフィニティー精製を行い、その収量を求める予定である。
また、S. marcescens以外にPseudomonas fluorescensやP. aeruginosaにもLip systemが存在するため、これらのMFPによってNbが分泌されるか否か検討し、より高効率な分泌生産系の探索も併せて行う。さらに、分泌に関わったC末端近傍のVTV配列は重鎖定常領域配列であり、抗原結合能に影響を与えないため、この周辺配列を性質の異なる各種アミノ酸に置換し、その影響を検討し、必要最小限かつ分泌効率の高いC末端付加配列を探索する。これらによって得られた研究成果を基に、より高効率な分泌システムの構築を行う。
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| Causes of Carryover |
オープンアクセスジャーナルに投稿する予定であったが、間に合わず、本年度使用額（その他）の一部を次年度へ繰り越すことになった。繰越し分を次年度、オープンアクセスジャーナルの掲載料に利用する予定である。
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