Identification of a receptor of a plant signal compound using new method for target protein identification

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07768
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 高橋 公咲 北海道大学, 農学研究院, 講師 (30374622)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松浦 英幸 北海道大学, 農学研究院, 教授 (20344492)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 標的タンパク質 / プローブ / リンカー

Outline of Annual Research Achievements

植物ホルモンのアブシジン酸およびその受容体AtPYL2をモデルとして、生理活性物質にアジド基を導入するだけで効率的に標的タンパク質を同定する方法の確立を目指した。
アブシジン酸にアジド基を導入したプローブと、末端アルキン、アミノ基およびビオチンを持つリンカーを合成した。組換えAtPYL2を発現させた大腸菌のタンパク質抽出液とプローブをインキュベートさせた後、プローブとリンカーをクリック反応で結合させた。分子内ジスルフィド結合を持つタンパク質架橋剤でリンカーとAtPYL2のアミノ基を架橋した。その後、本タンパク質溶液をビオチンと特異的に結合するストレプトアビジンカラムに供し、この3者複合体をストレプトアビジンカラムに結合させた。
カラム中のストレプトアビジンと非特異的に結合したタンパク質を高濃度のグアニジンを含むバッファーで十分に洗浄した後、カラムに還元剤（ジチオスレイトール）を含む高濃度グアニジンを含むバッファーを流した。
タンパク質溶出液のSDS-PAGEの結果、ほぼ単一のタンパク質バンドが得られた。その質量分析の結果、還元剤により架橋剤中のジスルフィド結合が切断されAtPYL2が選択的に溶出されたことが示された。本結果より、アジド基を持つプローブと末端アルキン、アミノ基およびビオチンを持つリンカーを用いて生理活性物質の標的タンパク質を同定できることが示された。本結果については、論文投稿準備中である。
本方法を用いて、シロイヌナズナのタンパク質抽出液からAtPYL2の同定を試みた。その結果、AtPYL2より分子量が小さいタンパク質がアブシジン酸の結合タンパク質として見出された。本結果から、アジド基の導入位置がシロイヌナズナのタンパク質抽出液からのAtPYL2の同定には適していないことが推定された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

標的タンパク質の精製：モデル実験ではあるが、当初の計画通り生理活性物質（アブシジン酸）にアジド基のみを導入したプローブと独自に開発したリンカーを用いて大腸菌タンパク質溶液から標的タンパク質（アブシジン酸受容体、AtPYL2）を精製することができた。本結果については論文投稿準備中である。しかし、シロイヌナズナのタンパク質抽出液からAtPYL2を精製することができなかった。その原因としてアジド基を導入した部位がAtPYL2-アブシジン酸-PP2C（脱リン酸化酵素）の複合体形成に重要な部位で複合体内部に隠れてしまったため、リンカーとプローブが接近できなかったためではないかと予想された。その一方で、未同定のアブシジン酸結合タンパク質と推測されるタンパク質を見出すことができた。今回の実験では本タンパク質量が微量であったため、その同定には至らなかったが、本方法が生理活性物質の標的タンパク質の精製に有効であることが示された。
Nano LC-MS/MSによる標的タンパク質の同定：架橋剤による標的タンパク質の修飾が標的タンパク質同定に対して悪影響を及ぼさないか心配されたが、トリプシン消化後の未修飾の複数のペプチド配列で十分に標的タンパク質が同定可能であることが示された。
これらの結果から、本研究課題はおおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

これまでの実験結果から、本方法により生理活性物質の標的タンパク質が同定可能であることが示された。当初の計画では、本標的タンパク質同定法を用いて平成30年度に12-オキソファイトジエン酸（OPDA）の標的タンパク質を同定した後、平成31年度に2-アザヒポキサンチン（AHX）の標的タンパク質の同定を行う予定であった。しかし、AHXにアジド基を導入したプローブが予定より早く合成できたため、AHXの標的タンパク質の同定実験を平成30年度に行う予定である。また、予想外の結果として、未知のアブシジン酸結合タンパク質の存在が示唆された。本タンパク質の同定も並行して行う予定である。

Causes of Carryover

現在使用しているゲル撮影装置が古くなり、新規にゲル撮影装置を購入設置する予定であった。しかし、古いゲル撮影装置がいまだに使用可能であり、新たなゲル撮影装置の購入はしなかったため、その費用の約400,000円が次年度使用額として発生した。今年度は新規にゲル撮影装置を購入する予定である。