2017 Fiscal Year Research-status Report

rDNAエピゲノムを調節する新たな栄養素同定とそれによるリボソーム制御の解析

Research Project

Project/Area Number	17K07798
Research Institution	Takasaki University of Health and Welfare
Principal Investigator	田中祐司高崎健康福祉大学, 薬学部, 助教 (90453422)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	リボソームRNA / 栄養素 / ニュートリエピゲノム / KDM2A / ヒストン脱メチル化
Outline of Annual Research Achievements	本年度は、細胞増殖を指標にしたＫＤＭ２Ａを調節しうる栄養素候補抽出の為のスクリーニング系構築を行った。High throughput解析に適応させるため、マルチウェルプレート上での解析が行える、自動写真撮影法、生細胞DNA量測定を通じた細胞数測定（CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay Thermo社）、アラマーブルー法による測定を検討した。検討対象とした栄養素のうち、約30種類の栄養素を抽出し試薬調整後ミニライブラリーとし、本実験系の構築に使用した。その結果、自動写真撮影法は微細な変化が検出できず、アラマーブルー法は栄養添加による代謝変動の影響を強く受けた為、本解析に適応できなかった。一方、生細胞DNA量測定を通じた細胞数測定は栄養添加による影響も弱く、細胞数をよく反映し解析に耐えうることが分かった為、この手法を用いてスクリーニングを行っていく事とした。ミニライブラリーの解析結果から、KDM2A依存的に増殖変化を誘導する栄養素が抽出出来た。MCF7細胞で特定濃度のL-val処理、フマル酸処理がKDM2A依存的に増殖変化を示した。ここで計画を変更して次年度計画していた候補栄養素の機能解析を先行して行う事とした。次に、L-val、フマル酸に加え予備検討で抽出されていたaKG、コハク酸処理によるKDM2A依存的な制御の解析を行った。その結果、フマル酸処理は特定の濃度域でKDM2A依存的にrRNA転写抑制を誘導する事が分かった。現在はその機序について解析を進めている。一方、aKG、コハク酸の細胞内量はメトホルミンによって誘導されるKDM2A依存的なrRNA転写調節に作用する事が明らかとなった。加えて、メトホルミン処理はコハク酸の量を、グルタミン除去はaKG量を変動させる事、これらの処理は、乳がん細胞の増殖に寄与する事が分かった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、研究計画の初めに設定した、細胞増殖を指標にしたKDM2Aを調節しうる栄養素候補抽出の為のスクリーニング系構築を完了した。構築には自身で作成した栄養素約30種のミニライブラリーを利用した。これは、当初計画した栄養素ライブラリーの価格が高く、系の構築が完了してから行う事が効率的と判断したためである。結果、生細胞DNA量測定を通じた細胞数測定が適切であると考え、本研究計画ではこの手法でスクリーニングする事とした。次年度以降、当初計画した栄養素ライブラリー全てを検討しKDM2A依存的増殖を示す栄養素を抽出する。次に系構築過程で抽出された栄養素がKDM2A依存的現象を誘導するかを検討した。これは、スクリーニングによる抽出がどの位精度よくできているか、先に検証するためである。スクリーニングの結果MCF7細胞で特定濃度のL-val処理、フマル酸処理がKDM2A依存的に増殖変化を示す事が分かったが、KDM2A依存的なrRNA転写調節が検出できたのはフマル酸のみであった。L-valについてはrRNA転写制御を介さずに増殖に作用していると考えられた。つまりスクリーニングによる抽出後真にKDM2A依存的rRNA転写制御を誘導するかどうかは個別に検証すべきである事が分かった。これに加えて、予備検討で抽出されていたaKG、コハク酸処理によるKDM2A依存的な制御の解析を行った。その解析結果は論文投稿に向け準備を進めている。初年度は以上の様な進展であった。個々の計画中で部分的に実験を延期した点と、先行して行った点が生じたが、相殺するとおおむね順当に進展していると考える。
Strategy for Future Research Activity	基本的に研究計画通りに研究を進展させる。結果を見て、より効率的な進展となる様、実験順は柔軟に変更する。初年度ミニライブラリーを用いた実験で決定したスクリーニング系（CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay Thermo社）を用いて、残りのライブラリーからKDM2A依存的な調節を誘導する栄養素抽出は研究計画最終年までに完了させる。既に該当の栄養素はいくつか抽出されている為、基本的には候補栄養素（L-val, フマル酸、aKG, コハク酸、グルタミン、ビタミンＣ）によるKDM2A制御機構解析を優先して進める。候補栄養素については、KDM2A依存的rRNA転写制御誘導の有無とエピゲノムへの作用や、KDM2A制御機構の解析を研究計画通りに進展させる。加えて、候補栄養素処理によるタンパク合成能への影響を検討する。まず、メチオニンアナログのL-homopropargylglycine取り込み法（Click-iTR HPG Alexa FluorR 488；Thermo社）による新合成タンパク質量測定を検討する。本手法の感度など実験に用いる事が出来るかは不明である為、検討の結果解析不可能となったら、別の方法を検討する。
Causes of Carryover	次年度使用額が生じた理由として、1年目に計画していたライブラリーを用いたKDM2A依存的な増殖変化を示す栄養素抽出のスクリーニング実験の一部を次年度以降実行に延期したためである。次年度使用額は翌年分と合わせ、残りのスクリーニング実験で消費する計画である。スクリーニング実験自体は研究期間内の完了を目指す。