2018 Fiscal Year Research-status Report
非コードRNAによる腸管上皮機能と腸内共生系の制御
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17K07801
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
高橋 恭子 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (70366574)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
細野 朗 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (70328706)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 腸管上皮細胞 / 非コードRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
食品を消化・吸収する腸管の管腔と体内は、単層の腸管上皮細胞(IEC)で覆われている。本研究では、非コードRNA(ncRNA)によるIECの機能制御とその機構、さらに腸内細菌との共生関係の成立・維持における役割を明らかにすることを目的とする。昨年度までに、腸内細菌によりIECにおいて発現が誘導されるncRNAによる腸管上皮透過性の亢進機構を明らかにした。今年度は、このmiR-21-5pによる上皮透過性亢進において鍵となる役割を果たす分子として同定した低分子量GTPアーゼARF4について、その機能を明らかにした。まず、マウスのDSS誘導性大腸炎モデルを用い、ARF4の発現が炎症上皮で高いことを示した。また、ARF4と結合する因子として細胞骨格・細胞形態の制御に関与する2つのタンパク質を同定した。さらに、ARF4を過剰発現するIEC株を樹立し、トランズウェルインサート上で分化させた後に免疫蛍光染色を行った結果、過剰発現株において細胞骨格が変化することが明らかになった。過剰発現株では、同定したARF4結合タンパク質の発現分布も異なり、ARF4はこれらのタンパク質の発現分布に影響を及ぼすことにより、細胞骨格を変化させることが示唆された。したがって、ARF4による上皮透過性亢進機構として、既に明らかにしていたタイトジャンクションタンパク質の発現抑制に加え、細胞骨格の制御を介する新たな機構が存在すると考えられた。一方、これまでに同定した腸内細菌依存的なncRNAについて、その発現を調節する腸内細菌の候補を抽出した。これらの結果は、腸内細菌叢の乱れに起因する腸管上皮透過性の亢進、腸管炎症の制御のための新たな標的の確立につながることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
腸内細菌依存的なmiRNAによる腸管上皮透過性の調節において鍵となる役割を果たすARF4について、マウスの大腸炎モデルを用い、ARF4依存的な上皮透過性の亢進が腸炎の誘導に関わる可能性を示した。さらに、ARF4が細胞骨格を制御するタンパク質と結合し、細胞骨格や細胞形態を変化させることを明らかにし、ARF4による腸管上皮透過性亢進の新たな機構の存在を示した。一方、小腸に比べて圧倒的多数の腸内細菌が存在する大腸のIECで小腸IECに比べて顕著に発現が高いmiRNAの機能を明らかにするため、インヒビターの導入条件を検討して決定した。現在、サンプル調製中であり、今後、プロテオーム解析に供してインヒビター導入により顕著に発現が変動するタンパク質を同定する予定である。以上、計画の一部を来年度に継続して持ち越しとなったが、おおむね計画に沿って研究を遂行することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
腸内細菌の大多数が生息する大腸のIECで特徴的に高発現するmiRNAおよび標的分子の機能解析を行う。このmiRNAのインヒビターを導入したIEC株を用いたプロテオーム解析において発現が顕著に変動した分子のなかから、miRNAの直接あるいは間接の標的候補分子を特定する。IEC株への候補分子のsiRNA導入実験等によるin vitroの解析に加え、マウスの腸炎モデルを用いたin vivoの解析により、腸管における炎症、共生における役割を明らかにする。また、腸内細菌依存的あるいは腸管部位依存的なmiRNAがIECからエクソソームの形で分泌されて機能することがあるかどうか、マウスの腸内容物からエクソソームを単離して測定する。さらに、機能が確認されたncRNAおよびそれらの標的分子について、食品因子による腸内共生系の制御のためのターゲットとしての有用性を評価する。
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| Causes of Carryover |
大腸IECに特徴的に発現するmiRNAの機能を明らかにするためのプロテオーム解析が平成31年度に持ち越しとなったため、平成30年度の予算の一部が繰り越しとなった。次年度の研究費は、このプロテオーム解析の費用に加え、実験用試薬（細胞培養関連試薬、トランスフェクション試薬・定量PCR試薬・抗体等の分子生物学および生化学実験試薬など）、実験用動物（マウス）、実験用消耗器具（細胞培養用フラスコ・プラスティックディスポーザブルチューブ・トランズウェルインサートなど）の購入のために使用する計画である。
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