2018 Fiscal Year Research-status Report

紅茶テアフラビン類の選択的合成を目指した酵素資源の探索と高生産システムへの応用

Research Project

Project/Area Number	17K07823
Research Institution	Nippon Veterinary and Life Science University
Principal Investigator	奈良井朝子日本獣医生命科学大学, 応用生命科学部, 准教授 (00339475)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中山勉東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (50150199)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	テアフラビン / 紅茶 / ポリフェノールオキシダーゼ / チロシナーゼ / カテキン
Outline of Annual Research Achievements	紅茶の赤橙色色素のテアフラビン（TF）類には様々な生理活性が見出されている。TF類は紅茶製造工程のうち、発酵と呼ばれる過程で2種類のカテキンが茶葉中のポリフェノールオキシダーゼ（PPO）によって酸化された後、重合して生成する。しかし、紅茶中の含有量が少ないため、TF類に関する研究・応用は容易に進展しない。本研究では、１）PPOのモデル酵素として利用されるマッシュルーム由来のチロシナーゼを用いたTF合成反応機構の解析、２）有用なPPO資源の探索、さらに、３）TFの効率的高生産にむけた条件検討をおこない、十分量のTF類を研究・応用の分野へ供給することを目的としている。前年度までに１）は一定の成果を得られたことから、平成30年度は２）を重点的に進めた。ジャガイモ、サツマイモ、ナス、リンゴ、ナシ、ゴボウ、バナナの皮などの酵素的褐変現象が知られる素材を用い、抽出方法の検討をおこなった結果、タンパク質回収量ならびにTF合成活性の高い酵素資源として、ゴボウとサツマイモを見出した。塩析で得られた粗酵素試料にアセトン沈殿処理を加えることで、目的とする酵素の比活性が上昇することを発見した。また、カテキン標品を用いて酵素試料の酵素学的性質の解析を進めており、今後はその結果に基づき、TFの効率的高生産へ利用できる固定化酵素調製と反応条件の検討を進め、３）の目的を達成する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 前年度、１）PPOのモデル酵素として利用されるマッシュルーム由来のチロシナーゼを用いたTF合成反応機構の解析によって得られた成果「当該反応中に生成する過酸化水素をカタラーゼで消去することでチロシナーゼの不活化を防ぎ、TF合成速度と収率が向上する」を、平成30年度のうちに農芸化学会で口頭発表し、学術論文としても投稿した(査読結果待ち)。また、２）有用なPPO資源の探索に重点をおいて実験を進め、抽出法の検討ならびに酵素活性評価法の見直しを重ねた結果、ゴボウとサツマイモからTF合成活性の高い粗酵素試料の調製に成功した。これらの粗酵素試料を用いて酵素学的性質やカテキン標品との反応特性を解析し、３）TFの効率的高生産の基礎となる知見を収集している。
Strategy for Future Research Activity	上述の計画1)2)で得られた情報をもとに、PPOモデル酵素のチロシナーゼまたはゴボウやサツマイモのPPOを含む粗酵素を用いたTF高生産システムの構築に向けて、これらの固定化酵素を調製する。そこに緑茶抽出物またはカテキン標品を反応させてTF合成条件の最適化を試みる。課題として、固定化していない遊離の酵素を緑茶抽出物と反応させた際に、カテキン標品を使った反応よりもTF合成反応速度が遅い傾向がある点が挙げられる。簡便かつ効率的なTF合成のため、緑茶抽出物を調製容易な基質として利用するメリットは大きいことから、緑茶抽出物中に含まれる阻害成分の探索やカテキン類の組成が酵素反応に及ぼす影響を追究し、緑茶抽出物を利用できる道筋を探りたい。このことから、緑茶抽出物という基質を用いるTF高生産システムの実現には当初予定していたよりも時間を要する可能性がある。
Causes of Carryover	前年度の備品購入額が申請していた額より抑えられたこと、今年度は分担者の中山が所属機関を異動し、異動先の立ち上げ等により当該研究課題への取り組みに遅れが生じたため。