2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒノキ栄養組織由来シングルセルからの効率的なクローン増殖技術の開発
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17K07867
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| Research Institution | Forest Research and Management Organization |
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Principal Investigator |
細井 佳久 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員 等 (50353842)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
丸山 毅 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所, 主任研究員 等 (20353865)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヒノキ / サワラ / 多芽体 / シングルセル / プロトプラスト / 不定胚 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒノキやサワラについて、組織・細胞培養技術を用いた植物体再生系の開発は、ゲノム編集などの遺伝子改変による育種を推進するために重要である。しかし、ヒノキ科樹木では、種子胚を利用した植物体再生系の開発は、ある程度進んでいるものの、茎葉などの栄養組織を用いた植物体再生系の開発はあまり進んでいない。そこで、無菌培養によりヒノキ、サワラの葉条切片からの器官形成条件の検索を行った。植物生長調節物質としてオーキシンとサイトカイニンを組み合わせ、硝酸アンモニウム濃度を1/2に下げたMS改変固形培地で、４ヶ月から６ヶ月間、培養することで多芽体を形成させることができた。得られた多芽体は、誘導時と同一組成の固形培地で継代培養可能であった。また、ヒノキでは、得られた多芽体を植物生長調節物質を含まない1/2MS固形培地に移すことでシュートを伸長させることができた。伸長したシュートを切り取り、オーキシンを含む1/2MS固形培地へ移すと発根し、植物体を再生させることができた。次に両樹種の多芽体についてメスで細断し、オーキシンとサイトカイニンを含む1/2MS、MS液体培地で暗黒下、振盪培養すると、２～３週間ほどで細胞の遊離、増殖が観察された。遊離細胞は、培養条件によりシングルセルの状態で長期間培養することが可能であることがわかった。また、これらの増殖細胞を浸透圧調節剤としてマンニトールを含み、セルラーゼRSとペクトリアーゼY-23を加えた酵素液で５時間静置処理すると、低率だがプロトプラスト単離が可能であることがわかった。また、両樹種の未熟種子胚をEM固形培地で培養することで、不定胚形成能力を持つ細胞を増殖させることができた。増殖細胞は、液体培地へ移して振盪すると、シングルセルの遊離が起こった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒノキ、サワラとも予定していた葉条切片から多芽体を誘導できた。多芽体は継代培養可能であり、今後実験材料として供給可能であることを確認できた。さらにヒノキでは複数個体について植物体再生系を確立できた。多芽体から誘導した培養細胞については、プロトプラスト化も可能であったが、直接シングルセルを得ることも可能であった。培養細胞の維持・増殖が可能であることも確認し、また、数週間程度で多芽体組織から誘導可能であることも明らかにできたため、次年度以降の細胞培養実験が順調に進められることが確認できた。また、比較のために行った種子胚からの培養細胞の誘導も達成できたため、全体としておおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
多芽体由来のシングルセルを含めた培養細胞について、植物体再分化を目指し、器官分化実験を行う。未熟胚から誘導した培養細胞について、植物体再分化実験を行う。上記実験を円滑に行うため、供試材料の育成・培養に努める。
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| Causes of Carryover |
非常勤職員の募集を行ったが、適任者が見つからなかったため。次年度、海外研究集会に参加し成果を発表する予定ができたので、旅費の一部として今年度の未使用額を使用する計画である。
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