Development of quantitative detection techniques on harmful algal cyst for assessment of potential risk of harmful algal blooms

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07899
• Research Institution: Fisheries Research and Education Agency
• Principal Investigator: 坂本 節子 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 瀬戸内海区水産研究所, 主任研究員 (40265723)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 有害有毒プランクトン / シスト（休眠期細胞） / 定量PCR / 発現遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

八代海等において有害プランクトンのシストの広域分布調査を実施し，シャットネラ属のシストを得た。本種シストの正確な定量法を確立するため，分離したシストを用いて，底泥のない環境下でDNA抽出法を検討し，rDNA LSU（D1-D2領域）を標的とする定量PCRで分析した。その結果，1)DNA抽出には強力な物理的細胞破壊が必要，2)細胞が破砕されれば簡易な抽出方法で検出可能，3)抽出溶液中の陽イオン除去（EDTA等の添加）が定量PCR反応に効果的，であることがわかった。また，シャットネラの栄養細胞は複相（2n），シストは単相（n）と報告されており，実際に栄養細胞1細胞当たりのrDNA濃度はシストの約2倍であることが確認された。次に，底泥混在下で細胞破砕とTE煮沸法の組み合わせによるDNA抽出を行い，定量PCRで分析した結果，rDNA濃度は底泥非存在下に比べて1/5以下に低下し，底泥によるDNA抽出阻害あるいは定量PCR反応阻害が起きていることが示唆された。そこで化学的なDNA抽出・精製法を検討した結果，1)フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出法では確実にDNAを抽出できたが，サンプル間の抽出効率がばらついた，2) Proteinase K法や市販の土壌DNA抽出キットISOIL for Beads Beatingでは一部の試料で非検出となり結果が安定しなかった，3）CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide)法ではすべて非検出となった。これらの結果から，底泥が混在しない場合，シスト細胞のDNAは簡易な方法で抽出可能であるが，底泥存在下ではシスト細胞からのDNA抽出には物理的な細胞の破砕，陽イオンの除去，泥由来阻害物質の除去，という過程が必要であることがわかった。本研究により，シストのDNA抽出方法に必要な過程の一部が明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

シストからのDNA抽出過程に必要な要素の一部を明らかにすることができた。一方で，もっとも良好なDNA抽出方法で得られた試料の分析結果は，サンプル間で濃度差にばらつきが出たが，その原因についてはまだ絞込みができていない。次年度は，安定したDNA抽出をするための条件を確定するため，さらに詳細な検討をすすめる必要がある。また，今年度は先行して入手が可能となったシャットネラ属シストから実験を開始することとなった。当初先行して研究を進める予定であったGymnodinium catenatumシストの抽出方法の検討についても平行して研究を進めている。

Strategy for Future Research Activity

次年度は，引き続き、有明海・八代海および瀬戸内海東部においてシストの広域分布調査を実施する。瀬戸内海（広島湾）でシスト密度と栄養細胞の発生との関係の経時的な調査を実施する計画であったが，対象海域では標的とするシャットネラやG. catenatumのシスト密度が非常に低いことから，次年度は適切な調査海域を探すための広域分布調査を中心に行う。底泥試料については検鏡計数したものと同じ試料を定量PCR分析試料とするため、マイクロチューブ等に回収し、凍結保存する。
また，引き続きシャットネラおよびG. catenatumシストの定量PCRによる定量のためのDNA抽出方法の検討を進め，至適な抽出条件を決定することを目指す。シストを基にした定量PCRの検量線を作成する。G. catenatumシストの発現遺伝子配列情報の解析を進め、シストの発芽マーカーとなる遺伝子候補を抽出する。

Causes of Carryover

今年度は，本研究のために実験補助員を1名×1ヶ月雇用する計画であったが，雇用できなかった。また，分析等に用いた試薬のほとんどを過去に購入，使用して残っていた試薬を用いることができたため，予定していた試薬の購入を控え，多くの次年度使用額が生じた。次年度は，実験補助員の雇用を予定しているので人件費が必要である。また，新たに多くの試薬の購入が必要であること，シストを得るために用いて破損したガラス器具の補充が必要であること，使用している野外調査機材の補修が必要であることなどから，これらの費用に当てる予定である。