2017 Fiscal Year Research-status Report

腸内細菌叢の代謝系がアワビの成長差に与える影響の解明

Research Project

Project/Area Number	17K07912
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	井上徹志長崎大学, 水産・環境科学総合研究科(水産), 教授 (10624900)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	守屋繁春国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (00321828)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	腸内細菌 / 共生
Outline of Annual Research Achievements	アワビや魚類の種苗生産では、著しい成長差が生じることが知られているが、その要因については不明な点が多い。本研究は腸内細菌叢の代謝系がアワビの成長差に与える影響の解明を目的としている。一般的に腸内細菌の多くが培養できないのに対して、アワビの腸内細菌叢の中で藻類由来の多糖類を分解する細菌群は培養可能である。本研究ではアワビ腸内細菌叢の解析を、培養法と培養を介さない遺伝子に基づく方法の２つのアプローチで進め、その統合を目指す。クロアワビ種苗を対象に、平成29年4月から平成30年1月まで、1ヶ月ごとに同一水槽内の200個体の殻長、殻幅を測定した。殻長の上位5％に当たる個体を大個体、下位5％に当たる個体を小個体とし、大個体と小個体の各3個体を腸内細菌叢の解析に用いた。生菌数およびアルギン酸分解菌数を計測すると同時に、ランダムに32コロニーを選抜し、単離株を作成した。得られた単離株について、各種糖質（アルギン酸、セルロース、寒天）に対する分解能を判定した。また、アルギン酸含有軟寒天培地を用いて各単離株の嫌気条件での酸生成能と運動性の判定を行った。腸内細菌叢の解析は、4月以降2ヶ月毎で年間4回を予定していたが、腸内細菌叢が予想より安定ではなく季節変動する可能性が予備的サンプリングで判明した。そのため、アワビのサンプリングおよび腸内細菌叢の解析を、5月から翌年の1月まで毎月の合計9回行った。さらに、着底から3ヶ月のアワビのサンプリングを平成30年3月に行い、食性が褐藻類になる前の個体の腸内細菌叢の解析を行った。その結果、アワビの成長が停滞する夏期にアルギン酸分解能と酸生成能をもつ単離株の割合が低下することが明らかとなった。さらに大個体と小個体の差も季節変動していた。宿主の成長と腸内細菌叢の相関を経時的に明らかにした研究はほとんどなく、今後の研究につながる重要な知見を得ることができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究は、アワビ腸内細菌叢を培養法と培養を介さない遺伝子に基づく方法の２つのアプローチで解明することを目的としている。本年度は、培養法に基づく解析については当初の計画以上に進展したが、遺伝子に基づく解析はやや遅れている。全体としては、おおむね順調に進展していると判断した。以下に具体的な進展状況を説明する。本年度はアワビ腸内細菌叢の経時変化を捉えるため年4回のサンプリングを予定していたが、季節変動をより明確に捉えるためにサンプリングを合計10回行った。従って、研究の目的１）にあげた、「着底から1年未満のクロアワビを用いて、成長優良個体と不良個体の腸内アルギン酸分解菌叢の経時的変化を培養法で明らかにする。同時に、アルギン酸分解菌の単離株を取得する」については、当初の計画以上に進展していると考えている。サンプリング回数を増やしたことにより、取得した単離株は当初計画の240株に対して640株となった。これに伴い、単離株の多糖類分解活性の判定や酸生成能の判定等の性状解析を優先したため、当初計画したアルギン酸分解能を示した単離株の16S rRNA遺伝子配列による種同定は次年度に持ち越すこととなった。また、アワビ腸内での発現遺伝子を網羅的に解析する、トランスクリプトーム解析のための予備実験を行う予定であったが、次年度に延期することとした。以上、サンプリング回数を増やしたことにより、腸内細菌叢の経時的変化を培養法で解析した点では、当初の計画以上に進展した。また、宿主アワビの成長と腸内細菌叢の経時的な変化を明らかにできたことから、今後のトランスクリプトーム解析のための重要な情報を得ることができた。一方、単離株の遺伝子解析、及びトランスクリプトーム解析の予備実験については、やや遅れているが、計画以上に進展し、新たな知見を得た部分もあることから、全体としてはおおむね順調に進展している判断した。
Strategy for Future Research Activity	クロアワビの種苗生産過程は、11月から12月に採卵・受精、その後付着珪藻を与えて海上で飼育、4月に稚貝を一旦回収し、餌を珪藻からワカメなどの褐藻類に変えて陸上の水槽で飼育となっている。平成29年度のサンプリングでは、5月以降の成長優良個体と不良個体の腸内細菌叢の経時的変化を培養法で解析してきたが、5月時点で成長優良個体と不良個体の腸内細菌叢には違いが認められた。従って、アワビの食性が珪藻食から藻類食に変わる前後の腸内細菌叢の変化を明らかにすることは、成長差と腸内細菌叢の関係を解明する上で、重要である。そこで、平成30年3月に着底から3ヶ月のアワビのサンプリングをすでに行って、解析中である。今後も食性変化時の腸内細菌叢の変化を捉えるため、4月から6月までに4回程度のサンプリングを予定している。6月以降は、前年の解析で明らかになった季節変動を検証するために2ヶ月に1回程度のサンプリングを予定している。平成29年度のサンプリングで取得した640株の単離株については、多糖類の分解活性等の性状分析はほぼ終了している。今後は、単離株の16S rRNA遺伝子配列による種同定をアルギン酸分解能を示した単離株を優先して進めていく予定である。アワビ腸内での発現遺伝子を網羅的に解析する、トランスクリプトーム解析については、サンプリング方法、サンプル量、核酸抽出方法等の最適化を検討し、データの取得を目指す。トランスクリプトーム解析については、研究分担者である守屋が中心となって遂行する。現時点では成長優良個体と不良個体の腸内細菌叢の違いが大きくなる、5-6月、9月、12月がサンプリングに最適と考えている。以上のように、培養法と培養を介さない遺伝子に基づく方法の２つのアプローチで腸内細菌叢の代謝系がアワビの成長差に与える影響の解明を進めていく。
Causes of Carryover	本年度はアワビ腸内細菌叢の経時的な変化を捉えるため、年4回のサンプリングを予定していたが、季節変動を明確に捉えるためにサンプリングを合計10回行った。サンプリング回数の増加に伴い、取得した単離株は当初計画の240株に対して640株となった。単離株の性状分析を優先して進めたため、当初計画していた単離株の遺伝子解析は次年度に持ち越した。培地や単離株保存用の消耗品は増加したが、高額となる遺伝子解析用の費用は発生したかったため、次年度使用額が発生することとなった。平成30年度に、単離株の遺伝子解析を遂行するため、次年度に持ち越した予算を使用する予定である。遺伝子解析には1株あたり1000円程度の費用を予定し、500株程度の解析を予定している。アワビ腸内での発現遺伝子を網羅的に解析する、トランスクリプトーム解析のための予備実験については、研究分担者である守屋を中心に本年度中に行う予定であったが、次年度に延期することとなった。培養法による解析を優先した研究遂行上の都合で、本年度予定していた解析を次年度行うことになったため、次年度使用額が生じることとなった。トランスクリプトーム解析については、予備実験、本実験とも平成30年度に遂行する予定である。