噛み合い防除のため切歯形成遺伝子を多重低機能化したトラフグ切歯の形態解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07923
• Research Institution: Fisheries Research and Education Agency
• Principal Investigator: 岡本 裕之 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, グループ長 (50372040)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤原 篤志 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 中央水産研究所, 主幹研究員 (30443352) ; 木下 政人 京都大学, 農学研究科, 助教 (60263125)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / トラフグ / 歯形成

Outline of Annual Research Achievements

作出した切歯形成遺伝子SCPPのF0編集個体において、これまで目視観察において歯の低形成個体が認めらなかったため、一部計画を前倒しして、SCPP遺伝子に加えて、哺乳類や他魚類で歯形成に関与が示唆されているMsx1、Msx2、Dax1、およびDlx1A、Dlx2A、Dlx3A を新たに標的に加えて、3-4種ずつ当該遺伝子の同時共編集を以下のように試みた。(1)SCPP1-g1、SCPP5-g1、SPARC-g1（発現組織Od-cr）、(2)SCPP3A-1、SCPP3B-1、SCPP3C-1（発現組織IPE）、(3)Dlx1A-E1-g1、Dlx2A-E1-g1、Dlx3A-E1-g1、Dlx3A-E1-g2、(4)Msx1-E1-g1、Msx1-E1-g2、Msx2L-E1-g1、Dax1-E2-g1、(5)SCPP2-g1、SCPP4-g1、SCPP5-g1、SPARC-g1（発現組織IDE）。変異導入条件には、これまでにブリにおいて、高いF0変異導入個体の作出効率と、変異導入個体ゲノムにおいて非常に高い変異導入率（ほぼ100％）を達成したCRISPR/Cas9顕微注入条件を採用した。設定した５試験区（各1000注入卵）のうち、3試験区で種苗期に疾病ならびに酸欠事故が発生し大半を失ったが、殺さずに歯の外部形態を観察できるサイズ（体長3-4㎝）まで育成し、各個体の歯を目視確認した。４編集区（(1)1尾、(2)1尾、(3)25尾、(4)22尾）において、歯の低形成個体は一尾も見られなかった。理由としては、編集魚が未編集魚に非常に初期の発育段階で駆逐されている、あるいは野生型との競合に負けている可能性が考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

F0世代（変異導入世代）で歯形成関連遺伝子の機能欠損解析を行うためには、同一個体内で変異が入っている細胞と変異が入っていない細胞が混在している状態（体細胞モザイク状態）を解消する必要がある。これまでにブリにおいて、非常に高い変異導入効率（個体作出率及び個体内編集率）を示すことができた導入条件を用いて、トラフグで変異導入を実施したが、歯の形成に目立った異常が見られた個体は得られなかった。一方、遺伝子によって変異が入りやすいもの、入りにくいものが想定されており、標的遺伝子として、SCPP遺伝子に加えて他の候補遺伝子についても編集を試みたが、歯の形態異常を示し、モルフォメトリー解析に供するような個体は得られなかった。

Strategy for Future Research Activity

今後より早い成長段階で、編集魚と未編集魚を分別して育成する方法として、海外の情報を参考に、ふ化直後から高い変異導入個体を選別できる技術について検討を行う。またこれまでに作出したSCPP遺伝子のモザイク編集個体F0について、次年度成熟が期待できるため、可能であれば次世代F1の作出を試み、F1（変異ホモあるいはヘテロ個体）の歯の形態と変異導入解析を行う予定である。

Causes of Carryover

歯の形態に異常をきたした編集個体を得られるまで、次世代シークエンサーの解析は延期することとし、ふ化直後の非常に早い発育段階で変異導入個体を分別できる技術開発を中心に研究を実施する。