2017 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of activated olfactory receptor neurons in salmon and non-target analysis of organic compounds for the natal river odorants
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17K07930
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
工藤 秀明 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (40289575)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | サケ / 母川回帰 / 母川刷込 / 嗅覚 / 有機化合物 / 嗅細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遡河性サケ属魚類の母川回帰には，幼稚魚期の降河時に母川のニオイを記憶する「母川刷込」が重要である。その刷込まれるニオイには母川水中のアミノ酸組成が関わることについては研究が進んでいるが，実際に河川水中に含まれる他の有機化合物については不明である。本研究では，北海道南部八雲町を流れる遊楽部川水系とそこに回帰・産卵するサケ（シロザケ）を研究対象とし，近接する母川と非母川から河川水を採集し，その中に含まれる有機化合物を高分解能の液体クロマトグラフィーと質量分析装置により網羅的に分析・比較することで新規の母川刷込ニオイ候補分子を探索し，そのニオイ分子に対するサケ回帰親魚の行動解析と実際にサケ親魚の嗅神経系のどの経路で情報伝達されるかを興奮した嗅細胞および脳内神経細胞のイメージングにより示し，サケ母川刷込におけるニオイの想起に関わる神経回路と新たな母川刷込ニオイ分子を明らかにすることを目的としている。初年度の平成29年度は，同じサケ属魚類であるサクラマスを用いて，蛍光標識10 kDaデキストランとニオイ分子（L-セリン）またはフェロモン候補分子（タウロコール酸）の同時曝露によるニオイ受容体依存性エンドサイトーシスを利用した蛍光剤を興奮嗅細胞へ取込ませる標識法を確立した。両分子に特異的に反応する嗅細胞の蛍光化に成功したが，曝露する両分子の濃度は通常受容している濃度に比べ相当高濃度にする必要があった。興奮した神経細胞で発現する最初期遺伝子cfosについては，サケ嗅覚中枢でcDNAクローニングを行った。行動学的試験では，非母川に設置した生簀に母川から輸送したサケ親魚に対して，上流部から各種試験水を流した後の魚の反応を上部からビデオ撮影した。その結果，母川水に特徴的な行動が認められた。河川水中の有機化学物網羅的分析用の試験水を春季と秋季に母川および非母川で採集し凍結保存を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ニオイ受容体依存性エンドサイトーシスによる興奮嗅細胞の蛍光可視化については、小型のサクラマスでは成功しているが、高濃度のニオイ分子の曝露が必要であるという問題点が生じ、実際に母川に戻ったサケ親魚での実施が行えていない。また、興奮神経細胞を検出するためのcfos遺伝子発現については、qPCRによる測定は可能になったがin situ ハイブリダイゼーションによる局在性の可視化までには至っていないため。
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| Strategy for Future Research Activity |
興奮細胞の検出には、末梢（鼻）ではニオイ受容体依存性エンドサイトーシスによる蛍光可視化、中枢（脳）では最初期遺伝子cfos遺伝子の検出を想定していたが、初年度の結果より、末梢および中枢ともに後者の手法に絞った方が良いと判断できたことから次年度以降はcfos発現検出に重点を置く予定である。河川水分析のサンプルが揃ったことから、予定通り有機化合物を高分解能の液体クロマトグラフィーと質量分析装置により網羅的に分析・比較したい。
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| Causes of Carryover |
（理由）
申請時の計画では超微量分光光度計（175万円）の購入を予定していたが、部局の共通機器として同等機種が導入されたため購入を取り止め、当初の計画策定時より価格が急騰した蛍光標識物質の使用量を大幅に増やし研究を進めたが繰越金が生じた。この蛍光標識物質の大規模投入による成果としてこの手法が不向きなことが明らかにされ、遺伝子関連試薬の配分を大きくする必要性が判明した。
（使用計画）
計画の修正により、興奮細胞の検出には蛍光標識物資の取込みではなく最初期遺伝子cfos発現検出に重点を置くためそれに関わる遺伝子関連試薬の購入に充てる予定である。
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