2018 Fiscal Year Research-status Report
魚類の生育温度依存的なマクロ栄養素嗜好性制御メカニズムの解明
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17K07933
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| Research Institution | Tokyo University of Marine Science and Technology |
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Principal Investigator |
長阪 玲子 東京海洋大学, 学術研究院, 助教 (90444132)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 嗜好性 / マクロ栄養素 / 味覚受容体 / 生育温度 / 魚類 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでにマウスで生育温度の違いが代謝の変動を導き，マクロ栄養素に対する嗜好性を変化させることを明らかにした．変温動物の魚類は生育水温の違いが直接代謝を変化させることから，マクロ栄養素嗜好性の変動を導くことが考えられる．昨年度までに小型実験魚における嗜好性評価系の確立を行った．そこで本年度はまず，昨年度確立した嗜好性評価系を用いて，ゼブラフィッシュにおける嗜好性の評価を行った．
ゼブラフィッシュを高温飼育，至適温度飼育，低温飼育の3区に分け，高タンパク質飼料，高炭水化物飼料を作製し，嗜好性試験を行った．その結果，水温によって食欲の変動を導いただけでなく，至適水温以外ではタンパク質嗜好性が高まる傾向があったことから，生育水温の違いによってマクロ栄養素の嗜好性が異なることを示唆した．また，代謝を著しく変化させるモデルとして絶食させた個体を用いて嗜好性試験を行った．その結果，絶食によって味覚受容体mRNA発現量が増加したが，視床下部における炭水化物嗜好性関連因子mRNA発現量は減少した．同様に嗜好性の評価においては，スクロースへの嗜好性が亢進した一方，コーンスターチに対する嗜好性が低下した．
また，哺乳類では，味覚受容体であるT1RsとT2Rsに共通の下流シグナル伝達因子TRPM5は温度感受性で，低温ほど活性化されにくく，感受性が低くなることが報告されている．また，哺乳類のT1Rsは甘味とうま味の受容体であるが，魚類ではアミノ酸に感受性の高い受容体であることが明らかになっている．そこでゼブラフィッシュのTRPM5および，その上流であるPOU2F3のゲノム編集によるノックアウトを試みた．ヘテロ二本鎖移動度分析によりDNA切断を確認したところ，50%の割合でノックアウト個体を得ることが出来た．今後，これらの個体を用いて嗜好性試験を行う．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は昨年度確立した蛍光色素を用いた嗜好性評価系を用いて水温の違いによる小型実験魚のマクロ栄養素嗜好性の違いについて検討した．その結果，生育水温の違いによってマクロ栄養素の嗜好性が異なることを示した．また，また，水温の違いは代謝の変動によるものと考え，代謝を著しく変化させるモデルとして絶食試験を行った．その結果，絶食によって味覚受容体mRNA発現量が増加したが，視床下部における炭水化物嗜好性関連因子mRNA発現量は減少した．同様に嗜好性の評価においては，スクロースへの嗜好性が亢進した一方，コーンスターチに対する嗜好性が低下した．このことから，絶食時に炭水化物嗜好性が低下すると同時に甘味嗜好性が向上すること，その機構には摂食嗜好性中枢の視床下部だけではなく，末梢である味覚受容体の発現も関与していることが示唆された．
これらの結果について学会発表を行っている．
また，TRPM5およびPOU2F3 のノックアウト個体は手に入れたが，それを用いた嗜好性試験は来年度に持ち越した．また，HEK293細胞にゼブラフィッシュTRPM5チャネルを発現させ，魚類のTRPM5活性が温度依存的であるかを検討する予定であったが，TRPM5のin-fusion cloning用プライマーを設計したのみで，発現させた細胞を用いた試験は来年度以降に持ち越した．
初年度産休を取得し初年度の途中からの事業開始となったため，やや遅れているとの判断に至った．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は本年度明らかになった生育水温による嗜好性の変化を引き起こすメカニズムを詳細に検討していく．具体的には，魚類の味蕾は舌上皮のみならず，鰓耙や咽頭などにも存在していることが明らかになっていることから，それぞれの部位における発現量にも着目し，水温変化による嗜好性の応答が味覚受容体発現を介したものかを検討する．
また，本年度同様生育水温によって発現量の異なるタンパク質および遺伝子にも着目し，二次元電気泳動や次世代シークエンスにより網羅的な解析を試み，味蕾および脳において水温変化によって変動する嗜好性制御関連因子の特定を目指す．さらに，予備的な検討により，アミノ酸の種類によっても嗜好性が異なる可能性を示したことからこれまでマクロ栄養素のみに着目していたが，生育水温の違いによるアミノ酸嗜好への影響についても検討する予定である．
また，次年度以降に持ち越したTRPM5およびPOU2F3 のノックアウト個体を用いた嗜好性試験を行う．これにより，生育水温の違いがどのシグナル伝達系に作用し，嗜好性の差異をもたらすのかを明らかにする．さらにHEK293細胞にゼブラフィッシュTRPM5チャネルを発現させ，魚類のTRPM5活性が温度依存的であるかを培地を異なる温度でインキュベートし，膜電位色素を用いて蛍光顕微鏡もしくは蛍光マイクロプレートリーダーにより評価する．本方法が難しい場合はカルシウムイメージング法を用いて検討する．
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| Causes of Carryover |
初年度に出産のため産前・産後休暇および育児休暇の取得により事業を一時中断したことが影響し次年度使用額が生じた．
育児休暇取得後に復帰し，既に事業を再開している．引き続き事業を行うことで次年度に本年度持ち越した研究内容を遂行し，交付額を使用予定である．
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