紅藻スサビノリ高水温耐性品種の生物学的特性発現の分子機構解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07935
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 柿沼 誠 三重大学, 生物資源学研究科, 教授 (60303757)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 紅藻 / スサビノリ / 環境応答 / トランスクリプトーム / 高水温耐性 / 高水温障害 / 選抜育種 / 養殖品種

Outline of Annual Research Achievements

近年，海水温の上昇傾向による養殖ノリの生産・品質低下が問題となっている．特にノリ養殖の根幹をなす育苗（殻胞子を幼葉まで育成して種網を作製）が著しい悪影響を受けるため，育苗期の高水温に耐えうる品種（高水温耐性品種）の開発が進められている．これまでに，育苗期の高水温に対して優れた体制を示す高水温耐性品種が選抜育種され，その高水温耐性に関わる生理学的特性が明らかにされている．そこで本年度は，高水温耐性品種の生物学的特性発現と高水温耐性の分子機構を明らかにするために，基準品種および高水温耐性品種のトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）を行った．
室内培養によりスサビノリ基準品種と高水温耐性品種（スサビノリ養殖品種から選抜育種）の殻胞子を採苗後，各品種の殻胞子付ノリ網を2つに分け，それぞれを高水温（24℃）および低水温（18℃）条件に移して14日間の育苗を行った．育苗後のノリ網から幼葉を回収して全RNAを抽出し，mRNAの精製・断片化を行った．断片化mRNAを鋳型としてランダムプライマーを用いて断片化cDNAを調製後，両端にアダプターを付加して4種類のcDNAライブラリー（高水温育苗－基準品種，低水温育苗－基準品種，高水温育苗－高水温耐性品種，低水温育苗－高水温耐性品種）を構築した．各cDNAライブラリーの次世代シークエンス解析により，総塩基数2.2 Gbpの塩基配列情報を取得することができた．さらに，塩基配列情報のアセンブル解析により，約8,600のコンティグ配列（平均370 bp/コンティグ，範囲200－3,236 bp）を得ることができた．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では，次世代シーケンサーを利用した網羅的トランスクリプトーム解析，遺伝子導入・発現系を利用した高水温耐性遺伝子の機能解析等を行い，スサビノリ高水温耐性品種の生物学的特性発現と高水温耐性の分子機構を明らかにすると共に，高水温耐性品種の選抜・特性評価に有効なマーカー遺伝子を特定することを目的としている．
本研究実施計画は（1）～（3）に大別され，本年度は当初計画通りに（1）基準品種および高水温耐性品種のトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）を実施した．ほぼ計画通りに研究が進み，育苗期のスサビノリ幼葉におけるトランスクリプトーム（転写産物）の全体像を反映するコンティグ配列を得ることができた．このコンティグ配列情報を利用して，次年度の研究実施計画（2）高水温耐性および高水温障害発症に関与するマーカー遺伝子の特定を進める．

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究実施計画（1）基準品種および高水温耐性品種のトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）のうち，未着手となっている遺伝子発現解析を行う．一定のリード数以上を含むコンティグを発現解析に供し，全リード数で標準化した各コンティグの出現頻度，すなわち高水温育苗－基準品種，低水温育苗－基準品種，高水温育苗－高水温耐性品種，低水温育苗－高水温耐性品種における転写産物の発現量を明らかにする．
次年度の研究実施計画（2）高水温耐性および高水温障害発症に関与するマーカー遺伝子の特定については，今年度の研究で得られたトランスクリプトーム解析データを利用して当初の計画通りに進める．高水温育苗－基準品種，低水温育苗－基準品種，高水温育苗－高水温耐性品種，低水温育苗－高水温耐性品種における発現遺伝子の比較解析データを基にに，高水温耐性品種の形質発現や基準品種の高水温障害発症の分子機構解析を進めると共に，各分子機構の鍵遺伝子（マーカー遺伝子）候補を抽出する．さらに，定量的PCR（qPCR）解析によりマーカー遺伝子候補の発現特性を詳細に調べ，高水温耐性品種の形質発現や基準品種の高水温障害発症に関与するマーカー遺伝子を特定する．

Causes of Carryover

（理由）本年度の研究実施計画（1）基準品種および高水温耐性品種のトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）に必要な解析用PC等の選定・導入が遅れたために，遺伝子発現解析を実施するに至らず次年度使用額（残額）が生じた．

（使用計画）本年度の研究実施計画（1）基準品種および高水温耐性品種のトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）のうち，未着手となっている遺伝子発現解析に次年度直接経費の約20％を使用する．次年度の研究実施計画（2）高水温耐性および高水温障害発症に関与するマーカー遺伝子の特定については当初の計画通りに進め，次年度直接経費の約50％をマーカー遺伝子候補のqPCR解析やcDNAクローニング等に必要な消耗品の購入に，次年度直接経費の約20％をqPCR解析等に必要な学内共同研究機器の利用費に使用する．また，次年度直接経費の約10％を学会発表等の旅費に使用する．