クルマエビ抗ウイルス因子の挙動および産生誘導機構の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07953
• Research Institution: Fisheries Research and Education Agency
• Principal Investigator: 米加田 徹 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 研究員 (40597944)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: クルマエビ / 抗ウイルス応答

Outline of Annual Research Achievements

クルマエビの抗ウイルス因子の挙動を把握するために，既報の抗ウイルス応答誘導因子を接種した個体と無処理の個体における血リンパ液のプロテオーム解析を実施した。二次元電気泳動像において血リンパ液中濃度に変動が認められた因子について，質量分析によるタンパク質の同定を行うとともに次世代シークエンサーにより取得したトランスクリプトームから遺伝子配列を特定した。

抗ウイルス応答候補因子について大腸菌を用いて組換えタンパク質を作製し，ウサギに免疫しポリクローナル抗体を得た。本抗体を用いたELISA法により，血リンパ液から当該抗ウイルス応答因子の検出は可能であったが，血リンパ液中の濃度が極めて低く濃度変化を把握することは困難であった。

血リンパ液中の抗ウイルス因子の挙動を高精度に測定するためには，血リンパ液中に多く含まれるタンパク質（Highly abundant proteins:HAP）を除去する必要があると考えられた。特にヘモシアニンは血リンパ液中タンパク質の90％程度を占めており，微量タンパク質の検出を困難にしている。そこで，クルマエビの血リンパ液によりマウスを免疫し，これらHAPに対するモノクローナル抗体の作出を試みた。ELISA法により96株のハイブリドーマから血リンパ液に特に強く反応する株のスクリーニングを実施した。クルマエビの血リンパ液に対して強い反応を示した12株を選択し，免疫共沈降法によりHAP除去効果の評価を実施したが，HAP除去に有用な株は得られなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

血リンパ液中に多く含まれるタンパク質（Highly abundant proteins:HAP）を除去するための抗体作出において，ヘモシアニンと結合性の高い抗体の作出を試みたが，モノクローナル抗体によるタンパク質の除去は効率が悪く，実際に解析系に導入することは困難であると考えられた。そのため，HAP除去にはポリクローナル抗体を利用することやHAPの性質を利用した方法など別のアプローチが必要である。

Strategy for Future Research Activity

クルマエビ血リンパ液中に多く含まれるタンパク質（HAP）を除去するための抗体作製の抗原としてヘモシアニンの組換えタンパク質を作製し，ポリクローナル抗体の作出を試みる。また，ポリエチレングリコール等を用いた方法によりHAP除去を試みる。血リンパ液中のヘモシアニンを除去し，ELISA法により抗ウイルス候補因子の変動を把握する。また，免疫組織化学法により，抗ウイルス因子の産生細胞の特定および局在について明らかにする。抗ウイルス性因子を産生する細胞集団を用い，試験管内で，ウイルス構成成分により刺激する。これらの細胞集団を経時的に回収し，網羅的な遺伝子発現解析を行い，刺激に応答する遺伝子群を特定する。これらの遺伝子群について，RNA干渉による網羅的遺伝子ノックダウンを実施し，抗ウイルス因子の発現が抑制される遺伝子を探索する。抗ウイルス因子の産生抑制遺伝子の合成RNAあるいは発現コンストラクトを細胞内に導入し，抗ウイルス因子の発現量の変化を測定する。これらの結果より，抗ウイルス性因子の産生に関わる遺伝子の特定を行う。