2018 Fiscal Year Research-status Report
Development of bovine ovarian activation and improvement of fertility by inhibiting the Hippo signaling pathway
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17K08048
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| Research Institution | Miyagi University |
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Principal Investigator |
小林 仁 宮城大学, 食産業学群(部), 教授 (40234827)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 卵胞活性化 / Hippo signal / Sphingosine 1-Phosphate / Jasplakinolide / CCN2 / Birc5 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウシの卵巣では1回の排卵に約1000個の卵胞がリクルートされるが、その多くは卵胞発育の過程で退行し最終的に排卵に至るのは1個である。もし、発育途中の二次卵胞を活性化することで卵胞の退行を抑制することができれば、発育途中の卵胞数が増加し、卵巣予備能や受胎率の向上が期待される。また、過排卵処理やOPU-IVFなど既存の技術と組み合わせることで胚生産の効率化にもつながる。そこで、初期卵胞の発育を制御しているHippoシグナル経路を卵巣組織の断片化やアクチン重合剤により抑制し、初期卵胞の活性化を試みた。実験Ⅰ：ウシ卵巣の断片化培養を行い、転写コアクチベーターであるYapの局在について免疫染色法を用いて調べた。培養開始時は、顆粒層細胞の細胞質にYapの局在が認められ、6時間後および48時間後には核内へのYapの移行が観察された。次に、組織断片化培養後の細胞増殖因子の関連遺伝子（CCN2, Birc5, CCN3, FGF1，SOX-2）の発現を調べた。Hippoシグナルの下流にある細胞増殖因子のCCN2およびBirc5遺伝子は、卵巣の断片化培養により増加傾向を示すものの、ばらつきが大きく有意差は認められなかった。実験Ⅱ：アクチン重合剤添加による組織断片化培養における細胞増殖因子の関連遺伝子の発現を調べた。スフィンゴシン１リン酸（S1P）添加によりCCN2およびFGF1遺伝子の発現が増加する傾向を示した。一方、同じくアクチン重合材であるオレオイル-L-α-リゾホスファチジン酸（LPA）では、細胞増殖因子の遺伝子発現に増加は見られなかった。さらに、細胞透過性の優れるJasplakinolide(Jasp)を用いて、遺伝子発現を調べたところCCN2およびFGF1遺伝子の亢進がみられた。アクチン重合剤の種類によって、細胞増殖因子関連遺伝子の発現促進効果に差異があることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
卵巣の断片化培養によりHippoシグナル経路が抑制されることを確認するため、転写コアクチベーターであるYapの局在を調べたところ、顆粒層細胞の細胞質から核内へのYapの移行が認められ、Hippoシグナル経路の抑制が示唆された。卵巣の断片化培養により細胞増殖因子の遺伝子の発現を調べたところ、卵巣採材から断片化培養までにかかる時間が、卵巣内の遺伝子発現量に影響することが示されたことから、卵巣培養は全て食肉処理場内で行った。卵巣断片化培養により、細胞増殖因子のCCN2やBirc5遺伝子の発現は増加を示した。アクチン重合材の添加では、S1PとJaspでは細胞増殖遺伝子の発現が亢進したのに対し、LPAは無添加と比較して発現量に差は見られなかった。アクチン重合剤の種類によって、ウシ卵巣のHippoシグナル経路の抑制程度に差がある可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
卵巣の断片化培養とアクチン重合化剤の添加によりHippoシグナル経路の抑制が確認されたことから、アクチン重合剤の至適濃度を明らかにするとともに、培養時間を延長し卵巣断片の組織標本を作製することで卵巣内の卵胞発育への影響を調べる。アクチン重合剤による卵胞発の育促進効果が観察された場合は、生体へのアクチン重合剤投与を試み、in vivoでの卵胞発育効果を調べる。さらに、活性化処理を経た卵子をOPUにより採取し体外受精法を行うことで、卵胞活性化により発生した卵子の発生能を調べる。
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| Causes of Carryover |
研究成果をASIAN AUSTRALASIAN ANIMAL PRODUCTION CONGRESS(AAAP) 2018で発表予定であったが、都合により発表を中止したためその予算が余った。今年度は、学会発表を2つ予定しており使い切れる額であるので問題はない。
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