2017 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of the spermatogenic ability in the testis of the cell adhesion molecules defective pigs using the genome editing technology
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17K08050
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
河原崎 達雄 東海大学, 農学部, 教授 (70500247)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
若山 友彦 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (70305100)
大竹 正剛 静岡県畜産技術研究所, 中小家畜研究センター 養豚・養鶏, 上席研究員 (90605677)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ブタ / 細胞接着分子 / ゲノム編集 / 精子形成 / CADM1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1）ブタ精巣から細胞接着分子CADM1を検出した。ブタ精巣において、CADM1は、中間型からB型精祖細胞、前細糸期から厚糸期の精母細胞と伸長精子細胞に発現し、円形精子細胞やセルトリ細胞には発現しなかった。
2）ブタCADM1遺伝子のExon1およびExon4領域の遺伝子配列について解析を実施したところ、品種により数か所の遺伝子多型が確認された。西洋種（デュロック種、大ヨークシャー種）に比べ、実験用ミニブタ（マイクロミニピッグ）で変異の頻度が高かった。
3）確認された遺伝子配列を基に、Exon1およびExon4領域の遺伝子領域を増幅する複数のPCRプライマーを設計し、ブタ胚からのDNA増幅条件を検討したところ、Nested PCR法を利用することにより目的の領域の遺伝子を増幅することが可能となった。
4）確認された遺伝子配列を基にcrRNAを設計し、エレクトロポレーション法で、ブタ胚（単為発生胚）に対してゲノム編集を実施した。単為発生の活性化刺激から3、6および9時間後にエレクトロポレーションによりgRNA complexおよび-Cas9 nucleaseを導入した。ゲノム編集率は、活性化3時間で最も高く（83.3％；11/13）、9時間では低く（33.3％；2/9）なり、全体では64.5％（20/31）であった。受精後早めのエレクトロポレーションによりゲノム編集率の効率が高くなることが示唆された。
以上の結果から、現在のゲノム編集システム；単為発生胚で有効性を確認したcrRNAを使用し、体外受精後早い時期に、エレクトロポレーションによりgRNA complexとCas9nucleaseを導入する方法でゲノム編集を行うことで、CADM1ノックアウトが可能であることが推測された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1)ブタ精巣から細胞接着分子CADM1を検出した。ブタ精巣において、CADM1は、中間型からB型精祖細胞、前細糸期から厚糸期の精母細胞と伸長精子細胞に発現し、円形精子細胞やセルトリ細胞には発現しないなど、おおむねマウスにおける発現に類似していることが明らかとなった。
2)crRNAを設計し、エレクトロポレーション法で、ブタ胚（単為発生胚）に対してゲノム編集を実施したところ、64.5％（20/31）の胚でゲノムが編集されていたことから、現在の実験方法でノックアウトブタ作製が可能であることが推察された。
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| Strategy for Future Research Activity |
1)有効性が確認されたCADM１遺伝子のExon1およびExon4領域に設定したcrRNAを用いてエレクトロポレーション法にゲノム編集を行い、レシピエントブタに移植し、産子を得る。
2)産子のゲノムを解析し、ゲノム編集の成否について解析する。
3)ゲノム編集の行われた個体について、精巣の発育、精液採取可能時期、精液性状等を確認したうえで、精巣の組織について解析する。
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| Causes of Carryover |
時間的制約のためゲノム編集胚の遺伝子解析が一部残った。このため少額ではあるが次年度使用額が生じた。
平成30年度は、ゲノム編集胚の解析を行うとともに、細胞接着分子ノックアウト個体作製および解析を行う。これらに必要なゲノム編集関係の試薬、ゲノム編集個体の解析のための試薬等を購入する。
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