Analysis of the spermatogenic ability in the testis of the cell adhesion molecules defective pigs using the genome editing technology

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K08050
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 河原崎 達雄 東海大学, 農学部, 教授 (70500247)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 若山 友彦 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (70305100) ; 大竹 正剛 静岡県畜産技術研究所, 中小家畜研究センター 養豚・養鶏, 上席研究員 (90605677)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: pig / cadm1 / ゲノム編集 / 胚 / 単為発生胚 / エレクトロポレーション

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、近年に開発されたゲノム編集技術を応用することにより、マウスの精巣において存在し、造成機能に影響を及ぼすことが報告されている細胞決着分子CADM1のヒトをはじめとした哺乳動物における普遍的な機能を解析するため、ヒトと生理的特性の近いブタで解析その組織における分布や機能を解析することを目的とした。
ゲノム編集技術のブタへの応用のための条件について検討して以下の成果を得た。1）ブタ単為発生胚により、ゲノム編集のために必要なgRNAの効果を判定できることを明らかにした。また、化学合成のCRISPR-Cas9スステムを用いて、エレクトロポレーション法によりｇRNAを導入することにより、安価で、安定したゲノム編集が可能であることを明らかにした。2）単為発生胚と体外受精胚を比較したところ、ゲノム編集の効果に差はないものの、エレクトロポレーション刺激に対する感受性が異なり、その後の発生に差が出ることが明らかとなった。3）体外受精胚では、エレクトロポレーション溶液の浸透圧を高め、パルス幅を短くし、電圧を低下させ、体外受精からエレクトロポレーションまでの時間をより長くすることが必要であった。これらの条件を満たしたうえでエレクトロポレーションを行うことにより、ゲノム編集後の胚発生率を高くすることが可能となった。
また、細胞接着分子のブタ組織での解析を行い、以下の成果を得た。1）ブタ精巣から細胞接着分子CADM1をはじめて検出した。2）ブタ精巣において、CADM1は、中間型からB型精祖細胞、前細糸期から厚糸期の精母細胞と伸長精子細胞に発現し、円形精子細胞やセルトリ細胞には発現しないことを確認した。ブタ造成組織においてマウスと類似した状態でCADM1が検出されたことから、造成機能に関する影響もマウスと同様に大きいことが推測された。今後はノックアウトブタによる解析により、より明確な機能が明らかにできるものと考えられる。