2017 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis of the HSP90 during development of the chick embryo.
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17K08053
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| Research Institution | Nippon Veterinary and Life Science University |
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Principal Investigator |
中尾 暢宏 日本獣医生命科学大学, 応用生命科学部, 准教授 (60377794)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ニワトリ / 発生・分化 / HSP90 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの鳥類の種卵は、適切な温度管理により胚の発生を停止、再開できる長期保存機構を備えている。この長期保存機構には、細胞周期や細胞分化の停止が考えられるが詳細な分子メカニズムは不明である。申請者は、この長期保存機構をニワトリ胚の発生の停止と再開機構に着目し、発生の制御に関与する148個の分子の抽出に成功した。さらにこれらの分子の解析からHeat shock protein 90 (HSP90)は、発生を制御する候補分子であることを見出した。ニワトリの発生過程は哺乳類に類似し分子レベルでは、本質的に脊椎動物と同じ基本過程が生じている事から、発生の停止と再開に関与する分子の発見は、養鶏業への応用のみならず発生生物学、組織工学の分野においても応用が期待できる。本研究では、HSP90によるニワトリ胚の発生停止と再開の人為的制御と機能解析を実施しHSP90による発生制御機構を解明することを目的とする。
HSP90は、全ての細胞に存在し全タンパク質の1-2%を占めることから、HSP90は、発生の停止と再開時の全ての組織で発現変動されていることが考えられた。そこで、発生の進んだE8のニワトリ胚を15度、湿度75%で24時間低温保存し発生を停止させたのちに37.5度、湿度75%の孵卵温度に移行し発生を再開させた際の0時間、6時間におけるHSP90の各組織の発現様式をホールマウントin situハイブリダイゼーションおよびホールマウント免疫染色により調べたところ、HSP90のmRNAおよびタンパク質ともに胚全体で発現していることが明らかになった。このことより、HSP90は、胚全体で発生の制御に関与していることが推察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度実施計画は、I. 孵卵温度刺激下における各組織のHSP90の発現様式、II. HSP90による細胞周期の制御である。Ⅱに関しては、in vitroの細胞培養系が確立できていること、30年度の研究計画でもあり計画が完了していないが、Ⅰに関してこの研究テーマを遂行する上で重要なポイントであるHSP90が胚全体で機能している可能性を示唆する結果が得られていることから、おおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度の計画でHSP90の発現が胚全体で発現していることが明らかになったが、mRNAおよびタンパク質の発現ともにフォールマウントで解析を実施したため、経時的な発現量の定量性に欠けるところがある。この点に関して、サンプリング可能な部位におけるウエスタンブロット解析にて経時的な定量を行う。
平成29年度に引き続いて、II. HSP90による細胞周期の制御について検討を行う。具体的には、in vitroでニワトリ胚の肝臓を初代培養し、培養温度を変化させることにより細胞周期の停止と再開を誘起させる。この培養条件下においてHSP90のノックダウンを行い、(1)HSP90のノックダウンによる細胞周期停滞の制御について解析を行う。さらに、HSP90を発現する発現ベクターを構築しHSP90遺伝子を一過性に過剰発現させることにより、 (2) HSP90による細胞周期進行の制御について解析を行う。これらの解析より、HSP90により細胞周期が制御できるのかを明らかにする。
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